Влияние интервала между сеансами OPU на результативность получения ооцитов при интенсивном использовании доноров локальных пород крупного рогатого скота
Получение ооцитов посредством пункции фолликулов (OPU) с последующим их использованием для получения эмбрионов in vitro (IVP-эмбрионы) приобретает всё более широкое использование в воспроизводстве сельскохозяйственных животных. Анализ мировых тенденций в коммерческом производстве эмбрионов крупного рогатого скота показывает постепенное замещение технологии вымывания эмбрионов после полиовуляции получением IVP-эмбрионов.
Основным источником получения IVP-эмбрионов являются ооциты, извлекаемые из овариальных фолликулов методом трансвагинальной УЗИ-ассистированной пункции (OPU). Экономическая эффективность технологии OPU/IVP напрямую зависит от количества жизнеспособных (пригодных) ооцит-кумулюсных комплексов (ОКК), которые могут быть получены за один сеанс OPU и определенный период использования доноров.
Один из подходов повышения результативности использования доноров — увеличение интенсивности проведения сеансов OPU. Было установлено, что при интенсивном использовании доноров (с периодичностью два раза в неделю, 2/w) в каждом из сеансов OPU в яичниках имеются фолликулы, пригодные для аспирации.
Было показано, что увеличение интенсивности сеансов с одного (1/w) до двух раз в неделю не приводило к снижению числа УЗИ-видимых фолликулов и извлекаемых ОКК за сеанс. Кроме того, в некоторых исследованиях отмечено улучшение качества ОКК при более интенсивном использовании доноров (2/w против 1/w).
В данных исследованиях, проведенных на коровах тагильской породы, было показано, что сокращение интервала между сеансами с 4 до 3 сут. обеспечивает увеличение числа УЗИ-видимых фолликулов и получаемых ооцит-кумулюсных комплексов (ОКК) без снижения качества ОКК, однако остается неясным, являются ли выявленные различия общей закономерностью или особенностью исследованной выборки животных.
Следует отметить, что практическая реализация режима 2/w предусматривает проведение сеансов OPU, как правило, с попеременным интервалом 4 и 3 сут., так как проведение сеансов OPU в одно и то же время суток является более предпочтительным с точки зрения организации труда специалистов. С другой стороны, различные интервалы между сеансами могут приводить к разной результативности OPU, что в свою очередь может потребовать корректировки временного режима использования доноров.
Цель работы — определение результативности OPU в зависимости от интервала между сеансами при интенсивном использовании доноров у крупного рогатого скота различных пород для оптимизации временного режима проведения аспирации фолликулов яичников для получения ооцитов.
Материалы и методы исследования
Экспериментальные исследования проводили в ФИЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста (Московская обл., Россия) в 2024 году на половозрелых телках холмогорской (n = 7) породы в возрасте 1,5–2 лет нормальной упитанности. Дополнительно в исследуемую выборку были включены данные, полученные авторами ранее на телках истобенской породы (n = 7) аналогичного возраста и упитанности и первотелках тагильской породы (n = 4) нормальной упитанности, находящихся на 5–6-м месяце лактации. Эксперименты с животными проводились в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях.
Протоколы с использованием животных были одобрены Комиссией ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста по биоэтике. В дневное время животные содержались на пастбище, в ночное время — беспривязно под навесами. Все доноры получали стандартный рацион, включающий зеленую массу и концентраты, сбалансированный по энергии, питательным и биологически активным веществам, в соответствии с нормами потребностей.
Опытные животные были подвергнуты гормональной синхронизации полового цикла. С этой целью за 9 сут. до планируемого прихода животных в охоту (день 0) донорам внутримышечно вводили 0,5 мг аналога гонадотропного релизинг-гормона гонадолерина (ГнРГ1) (5 мл фертагила) (Intervet, Нидерланды). Через 7 сут. после инъекции ГнРГ1 (за 2 сут. до прихода в охоту) внутримышечно инъецировали 0,75 мг синтетического аналога простагландина F2α клопростенола (3 мл эстрофана) (Bioveta, Чехия). В день 0 выполняли вторую инъекцию 0,25 мг гонадолерина (ГнРГ2) (2,5 мл фертагила) (Intervet, Нидерланды). Начиная с 4-го дня гормонально синхронизированного полового цикла на каждом из доноров выполняли 9 последовательных сеансов OPU в режиме дважды в неделю (2/w) с попеременным интервалом 4 сут. и 3 сут. (за исключением одного сеанса OPU у донора истобенской породы, который не был проведен по причине беспокойного поведения).
Для проведения аспирации фолликулов использовали систему для OPU у крупного рогатого скота (Minitube, Германия). В качестве аспирационной жидкости использовали фосфатно-солевой буфер (ФСБ) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС), 18 МЕ/мл гепарина и 50 мг/мл гентамицина.
Оценку качества полученных ОКК проводили по морфологическим критериям на основании числа и целостности слоев кумулюса, а также прозрачности и гомогенности цитоплазмы. ОКК хорошего качества и удовлетворительного качества считали пригодными для культивирования in vitro. Дегенерированные ОКК (с явными цитоплазматическими аномалиями) считали непригодными и в дальнейшей работе не использовали.
Результативность OPU оценивали по следующим показателям: число УЗИ-видимых фолликулов на неовуляторном и овуляторном яичниках, общее число фолликулов, общее число полученных ОКК, степень извлечения ОКК, число пригодных ОКК, доля пригодных ОКК (отношение числа пригодных ОКК к общему числу извлеченных ОКК, выраженная в процентах).
Для характеристики влияния породы проводили сравнение вышеназванных показателей между исследуемыми породами.
Оценку достоверности различий определяли на основании использования непараметрического критерия Манна — Уитни для независимых выборок.
Достоверность различий между группами с различным интервалом между сеансами внутри исследуемых пород оценивали с использованием непараметрического T-критерия Вилкоксона для двух зависимых выборок. Минимальный порог достоверности выявленных различий был установлен на уровне p < 0,05.
Результаты и обсуждение
Все опытные животные (вне зависимости от породы) проявили ответ на синхронизацию, что выражалось в наличии признаков охоты в ожидаемый день. Ультразвуковое картирование яичников показало наличие у всех животных на одном из яичников предовуляторного доминантного фолликула. Таким образом, все доноры на начало проведения эксперимента находились в фолликулярной фазе полового цикла. Так как у части животных овуляция имела место в день прихода в охоту, а у части животных — на следующий день (то есть наблюдалась незначительная асинхронность овуляции), результаты 1-го сеанса OPU при проведении расчетов не учитывали.
Характеристика результативности OPU у доноров различных пород дана в таблице 1.
Как следует из данных (табл. 1), не наблюдалось достоверных различий в показателях результативности OPU при проведении сеансов в режиме 2/w между телками истобенской породы и первотелками тагильской. С другой стороны, отмечено достоверное превосходство телок холмогорской породы над донорами двух других пород по показателям числа УЗИ-видимых фолликулов (p < 0,01), числа полученных ОКК (p < 0,01), числа пригодных ОКК (p < 0,01). Достоверное (p < 0,01) превосходство телок холмогорской породы в степени извлечения ооцитов отмечалось только по отношению к телкам истобенской породы. Различий в доле пригодных ОКК между породами выявлено не было.
Результаты сравнительного анализа фолликулярного паттерна на неовуляторном и овуляторном яичниках при использовании различного интервала между сеансами у доноров исследованных пород крупного рогатого скота представлены на рисунке 1.
Как показано на рисунке 1, наибольшее число фолликулов, как на неовуляторном яичнике, так и на овуляторном, при использовании обоих временных режимов было обнаружено у телок холмогорской породы — 6,14 ± 0,39 и 7,04 ± 0,43 фолликулов при интервале 4 сут. и 6,82 ± 0,46 и 6,46 ± 0,56 фолликулов при интервале 3 сут. соответственно.
Наименьшее число фолликулов на неовуляторном яичнике при использовании обоих временных режимов было выявлено у телок истобенской породы — 3,89 ± 0,31 фолликулов при интервале между сеансами 4 сут. и 4,11 ± 0,31 фолликулов при интервале 3 сут., на овуляторном яичнике у коров тагильской породы — 4,50 ± 0,60 и 4,25 ± 0,58 фолликулов соответственно.
Проведенный статистический анализ не выявил достоверного влияния интервала между сеансами на число визуализированных фолликулов как на неовуляторном, так и на овуляторном яичнике у всех исследованных пород (рис. 1).
Как следует из данных (рис. 2), хотя наблюдалось незначительное превосходство в общем числе фолликулов при интервале между сеансами 3 сут., достоверных различий по данному показателю при использовании двух различных интервалов между сеансами у доноров всех трех исследованных пород выявлено не было. Общее число УЗИ-видимых фолликулов при интервалах между сеансами 4 сут. и 3 сут. составило: 12,96 ± 0,69 и 13,50 ± 0,77 фолликулов, соответственно, у телок холмогорской породы; 8,70 ± 0,51 и 9,46 ± 0,72 фолликулов у телок истобенской породы; 8,88 ± 0,90 и 9,88 ± 0,84 фолликулов у первотелок тагильской породы.
Если у первотелок тагильской породы при интервале между сеансами 3 сут. отмечалась достоверно более высокая степень извлечения ооцитов — 57,59% против 45,77% (p < 0,05), то у доноров холмогорской и истобенской пород при незначительно более высокой степени извлечения ооцитов при интервале между сеансами 3 сут. по сравнению с 4 сут. (61,64% против 60,33%, соответственно, 43,40% против 40,43%) достоверных различий выявлено не было.
Несколько большее число УЗИ-видимых фолликулов и достоверно более высокая степень извлечения ооцитов, наблюдаемая у первотелок тагильской породы при использовании интервала между сеансами 3 сут., обусловливала получение достоверно большего числа ОКК по сравнению с интервалом между сеансами 4 сут. — 5,69 ± 0,64 против 4,06 ± 0,59 ОКК (p < 0,05). У доноров холмогорской и истобенской пород хотя и отмечалось некоторое превосходство в числе полученных ОКК при интервале между сеансами 3 сут., достоверных различий выявлено не было — 8,32 ± 0,75 против 7,82 ± 0,59 ОКК, соответственно, и 3,82 ± 0,40 против 3,52 ± 0,57 ОКК (рис. 2).
Данные о числе и доле пригодных ОКК, полученных при различных интервалах между сеансами у доноров исследованных пород крупного рогатого скота, представлены на рисунке 3.
Как следует из данных (рис. 3), различные интервалы между сеансами OPU не оказывали заметного влияния на качество извлекаемых ОКК: доля пригодных ОКК при интервале между сеансами 4 сут. по сравнению с 3 сут. составила: 73,52% против 77,25%, соответственно, у телок холмогорской породы; 72,63% против 67,83% у телок истобенской породы; 70,77% против 70,33% у первотелок тагильской породы. Не было выявено достоверных различий в числе пригодных ОКК при использовании двух различных интервалов между сеансами у доноров всех трех исследованных пород.
Среднее число пригодных ОКК при использовании интервалов между сеансами 4 сут. и 3 сут. составило 5,75 ± 0,54 и 6,43 ± 0,66, соответственно, у телок холмогорской породы, 2,55 ± 0,45 и 2,79 ± 0,48 — у телок истобенской породы , 2,88 ± 0,53 и 4,00 ± 0,50 — у первотелок тагильской породы.
Выводы
Установлено превосходство в степени извлечения ОКК у лактирующих первотелок тагильской породы при проведении OPU с интервалом 3 сут. по сравнению с 4 сут., что обусловливало получение большего числа ОКК. С учетом отсутствия достоверных различий в вышеназванных показателях у телок холмогорской и истобенской пород данные различия можно рассматривать как особенность исследованной выборки доноров тагильской породы. При проведении сеансов OPU с интервалом 4 сут. и 3 сут. число полученных ооцит-кумулюсных комплексов, пригодных для использования в системе получения эмбрионов in vitro, у доноров всех трех исследованных пород достоверно не различалось и составило 5,75 ± 0,54 против 6,43 ± 0,66, 2,55 ± 0,45 против 2,79 ± 0,48, 2,88 ± 0,53 против 4,00 ± 0,50, соответственно. В связи с этим данный временной режим может быть в дальнейшем использован для получения ооцитов у доноров вышеназванных пород крупного рогатого скота.
Об авторах
Роман Юрьевич Чинаров, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник лаборатории эмбриональных технологий
roman_chinarov@mail.ru https://orcid.org/0000-0001-6511-5341
Виктория Александровна Луканина, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории эмбриональных технологий
kristybatle@gmail.com https://orcid.org/0000-0003-4744-7873
Алан Юрьевич Джагаев, аспирант, младший научный сотрудник лабораторияи криобиологии
alan_dz@inbox.ru https://orcid.org/0000-0001-7818-0142
Галина Николаевна Сингина, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории эмбриональных технологий
g_singina@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-0198-9757
Федеральный исследовательский центр животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, пос. Дубровицы, 60, г. о. Подольск, Московская обл., 142132, Россия
УДК 636.082
DOI: 10.32634/0869-8155-2025-393-04-95-100
