Перспективы применения пробиотических микроорганизмов при производстве ферментированных продуктов на соевой основе
Продукты питания могут быть не только источником основных питательных веществ и энергии, но и позиционироваться как способ поддержания и улучшения здоровья и, кроме того, как способ профилактики и коррекции определённых негативных явлений в организме.
В условиях роста населения, перехода на новые рационы питания и изменения климата, содействие полноценному питанию и развитию здоровых и устойчивых продовольственных систем является главной задачей нашего времени.
Взаимосвязь между едой и здоровьем изучается на протяжении многих лет, и поэтому разработка продуктов, способствующих укреплению здоровья и благополучия, является ключевым приоритетом исследований пищевой промышленности.
В последние годы возросло значение продуктов, оказывающих направленное положительное влияние на здоровье и состояние организма. Такие продукты объединены в отдельный класс – функциональные продукты.
Несмотря на то, что спрос на продукты для функционального питания неуклонно растет, поскольку люди становятся все более осведомленными о значении диеты и питания, угроза стремительного роста и «омоложения» хронических заболеваний все еще остается актуальной, что связано с ухудшающейся экологической обстановкой и возрастанием стрессов.
В связи с этим, пищевая промышленность за последние несколько десятилетий быстро реагирует на изменение потребностей потребителей.
На сегодняшний день существует также актуальная проблема нарушения в работе микробиоты человека, что обусловлено нерациональным питанием и экзогенными факторами, сопряженными в первую очередь с образом жизни и индивидуальными привычками. Экологические проблемы, стресс, чрезмерное потребление быстроусвояемых углеводов, прием антибиотиков ведут к нарушению баланса микрофлоры кишечника. Микроорганизмы, населяющие кишечник человека, связаны с целым рядом различных заболеваний, включая воспалительные заболевания кишечника, болезни сердца, ожирение, диабет 2 типа, рак толстой кишки, рассеянный склероз, депрессию, аутизм, «болезни века», такие как болезнь Альцгеймера и Паркинсона, и инфекции, вызванные бактериями Clostridium difficile.
Основной путь для решения указанной проблемы – это нормализация собственной микрофлоры с помощью пробиотических бактерий. Несмотря на то, что молочные продукты, в том числе ферментированные пробиотическими микроорганизмами являются наиболее популярными на рынке, стремительно растет спрос на продукты на растительной основе, которые будут удовлетворять потребности людей, страдающих непереносимостью лактозы или гиперхолестеринемией, гиперчувствительностью к белкам животного происхождения, а также связанными с религиозными и моральными убеждениями.
В настоящее время продуктам растительного происхождения уделяется большое внимание из-за их потенциальной пользы для здоровья и большого внимания потребителей. Они могут быть источником легкодоступной здоровой и сбалансированной пищи для населения.
Кроме того, ожидается, что к 2024 году мировой рынок растительных продуктов, как альтернатив животному молоку, превысит 38 миллиардов долларов и 43,8 миллиарда к 2028 году. Эксперты отмечают существенный рост продаж продуктов на растительной основе в последние годы, который обусловлен не только модными трендами, а также ростом осведомленности потребителей в сфере этики и экологии. При создании продуктов на растительной основе существует ряд проблем, связанных с органолептическими характеристиками продукта, а именно, невыраженный вкус без использования ароматизаторов и специфические посторонние вкус и послевкусие, свойственное растительным компонентам. Например, согласно сенсорному тестированию в исследованиях коровье молоко неоднократно предпочитали растительному как взрослые, так и дети. Было отмечено, что вкус растительного молока является важнейшим фактором при выборе.
Среди различных видов растительного молока соевое молоко является одним из самых популярных на мировом рынке и по оценкам экспертов составляет 7.3 миллиарда долларов и продолжает развиваться. Соевые бобы (Glycine max) являются одними из наиболее широко выращиваемых и потребляемых бобовых культур во всем мире благодаря своему особенному составу питательных веществ. Соя не только содержит высококачественный белок, включающий почти все незаменимые аминокислоты с высокой усвояемостью (92-100%), но также является богатым источником минералов, таких как кальций, калий, магний, железо, цинк и медь.
Ферментированное соевое молоко эффективно снижает симптомы сахарного диабета, кровяное давление, снижает риск сердечно-сосудистых заболеваний, рака простаты, остеопороза и осложнений, связанных с онкологическими заболеваниями. Растительное сырье и продукты на его основе могут быть использованы как в качестве систем доставки пробиотических микроорганизмов в организм человека.
Кроме того, ферментация растительных дисперсий может позволить улучшить органолептические и функциональные показатели. Ферментация пробиотическими микроорганизмами может улучшить растворимость растительного белка, а также аминокислотный состав и их доступность для организма.
Процесс ферментации позволяет увеличить содержание биологически активных веществ, в том числе антиоксидантов, защищая организм от окислительного стресса и связанных с ним заболеваний. Антиоксидантная активность растительного молока обусловлена фенольными соединениями, флавоноидами и витаминами А, Е и С.
Более того, переваривание полезных белков соевых бобов улучшается более чем на 40% за счет увеличения содержания незаменимых аминокислот во время ферментации. Кроме того, ферментация молочнокислыми бактериями позволяет снизить содержание фитатов и ингибиторов трипсина.
Цель исследований – Изучение возможности и оценка перспективности ферментации соевой дисперсии штаммами бактерий Lactobacillus, Bifidobacterium, Propionibacterium, и Streptococcus при использовании их в качестве монокультурных заквасок.
Материалы и методы исследования
При проведении исследований использовали соевые бобы сорта «Припять», ООО «АПК КОЛОС» (массовая доля белка 42-43%, массовая доля жира 20%, влажность 9%), заквасочные пробиотические культуры: Lactobacillus acidophilus 57S (Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт», Россия); Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Yo100, Micromilk s.r.l., Италия); Bifidobacterium bifidum (LYOBAC-D, ALCE, Италия); Bifidobacterium longum B379M (ООО «Пропионикс», Россия); Propionibacterium freudenreichii subsp. shermani KM-186 (ООО «Пропионикс», Россия); Streptococcus thermophilus (Danisco TA 40 LYO 50 DCU, Дания).
Для приготовления растительной дисперсии из сои, растительное сырье замачивали в соотношении 1:3 (сырье:вода) на 12 ч, затем воду сливали. Данная операция позволяет удалить ингибиторы ферментов, а также размягчить клеточные стенки растительного сырья для облегчения дальнейшей обработки.
Далее добавляли фильтрованную воду в соотношении 1:10 (сырье:вода) и измельчали с помощью электрического блендера (Philco®, модель PH900). Данное соотношение позволяет получить желаемую по вязкости, однородности и слабо выраженному привкусу и запаху сои жидкую консистенцию растительной дисперсии (вязкость растительной дисперсии при температуре 20 °С – 1,71 сП). Вязкость растительной дисперсии и молока коровьего определяли с помощью вискозиметра Гепплера (RHEOTEST Messgerate Medingen GmbH, Германия) с падающим шариком №1. После измельчения, полученную смесь фильтровали через лавсановую ткань (плотность 140 г/м²).
Полученную растительную дисперсию подвергали термообработке в Термомиксе® (поставщик ООО «Грин лайн», Россия) при скорости 2 при температуре 85 °С в течение 5 мин, чтобы обеспечить стабильность гомогенности системы и микробиологическую безопасность в соответствии с ТР ТС 021/2011 (КМАФАнМ, 1х104 КОЕ/г; Дрожжи и плесени, КОЕ/г, не обнаружены; БГКП, не обнаружены в 1,0 г, в 0,1г; S. aureus, не обнаружены в 1,0 г; B. cereus, не обнаружены в 0,1 г).
Показатели качества растительной дисперсии представлены в Таблице 1.
Для получения биомассы микроорганизмов, культивирование проводили на жидких стерильных питательных средах: MRS (HiMedia, Индия) для L. acidophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, B. bifidum, B. longum и M17 (HiMedia, Индия) для S. thermophilus путем инокуляции чистой культуры в питательную среду и последующей инкубации в термостатах при 37°C в течение 48 часов. P. freudenreichii subsp. shermanii культивировали на жидкой питательной среде с лактатом натрия и инкубировали при 30°C в течение 96 часов. Для получения биомассы микроорганизмов, культивирование проводили на питательных средах в течение 48-96 ч. Полученную биомассу микроорганизмов концентрировали центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин. Далее проводили отделение биомассы и добавление криопротектора.
После тепловой обработки соевую дисперсию охлаждали до температуры заквашивания и вносили полученный концентрат пробиотических бактерий в количестве 0,1 % от объема растительной дисперсии. Ферментацию проводили до достижения РН 4.6-4.8.
Измерение активной кислотности проводили с помощью pH-метра HANNA HI98127, Hanna Instruments. Титруемую кислотность измеряли методом титрования с индикатором фенолфталеином.
Содержание пропионовой кислоты было определено с использованием ВЭЖХ системы Shimadzu LC-20 Prominence в соответствии с методами с некоторыми модификациями. Ферментированные образцы в количестве 25 мл были смешаны с 0,001 M H2SO4 и отцентрифугированы при 10 000 об / мин в течение 15 мин. Полученные супернатанты фильтровали через нейлоновый фильтр. Объем образца для определения составил 10 мкл. Сухие вещества определяли гравиметрическим методом. Содержание клетчатки определяли согласно методу AACC. Содержание углеводов определяли расчетным методом. Содержание золы определяли согласно ГОСТ 13979.6-69.Определение белка определялиметодом Кьельдаля согласно ГОСТ 26889-86. Массовую долю жира определяли по ГОСТ 8756.21-89.
Содержание полифенолов определяли c использованием спектрофотометра UV-1800 (Shimadzu, Япония).
Определение антиоксидантной активности образцов до и после ферментации проводили спектрофотометрическим методом с некоторыми модификациями. Коротко, для приготовления экстракта растительной дисперсии 2,5г исследуемого образца смешивали с 10 мл этанола (95%), тщательно перемешивали и центрифугировали 10 минут при 6000об/мин. Реактив DPPH (0,1мМ)растворяли в 95% этаноле. Вносили 250 μl водного экстракта соевой дисперсии или водного экстракта ферментированной дисперсии смешивали с 3 мл этанольного раствора DPPH. Смесь инкубировали в темноте в течение 30 мин. Значения оптической плотности замеряли при 517 нм (UV-1800, Schimadzu). В качестве контрольного образца был использован этанол вместо экстракта.
Выживаемость пробиотических бактерий определяли путем посева 1 мл серийных разведений (с 10-1 по 10-10) в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия на питательную среду глубинным посевом в чашках Петри.
MRS агар (HiMedia, Индия) использовали для подсчета Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Bifidobacterium longum,
Bifidobacterium bifidum, M17 агар (HiMedia, Индия) — для Streptococcus thermophilus). Инкубирование проводили при 37°C в течение 48 ч. Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii культивировали на лактатном агаре (HiMedia, Индия) при температуре 30°C в течение 96 ч. Полученные результаты выражены Log10 КОЕ / мл. Исследования проводили в соответствии с методиками, представленными в ГОСТ 33924—2016, ГОСТ 33951-2016
Все эксперименты проводились в трех повторностях. Данные выражали как среднее значение ± стандартное отклонение. Сравнение различных выборок проводили с помощью программного обеспечения Microsoft Office Excel Результаты считали достоверными при р ≤ 0,05.
Результаты и обсуждение
На первом этапе исследований оценивали изменение активной кислотности при ферментации соевых дисперсий. На рисунках 1–3 представлены данные об изменении активной кислотности и титруемой кислотности в процессе ферментации растительной дисперсии из сои при использовании различных заквасочных микроорганизмов.
Кислотонакопление является очень значимым процессом, происходящим при ферментации для формирования вкусо-ароматических веществ в разрабатываемом продукте. Изменение титруемой кислотности, а также рН в процессе ферментации также позволяет косвенно судить об адаптации микроорганизмов к растительной матрице.
Наиболее активно процесс ферментации проходит при использовании L. bulgaricus и P. schermanii KM-186 в течение 6 ч, при этом, диапазон изменений рН для данных образцов составил от 6,81-6,86 до 4,71-4,8. Прирост титруемой кислотности – 0,097% молочной кислоты и 0,076% пропионовой кислоты, соответственно. Наиболее длительный процесс ферментации происходил при использовании L. acidophilus 57S. Снижение значений рН до 4,73 для данных образцов происходило за 8 ч, при этом, прирост молочной кислоты составил 0,387%.
Несмотря на то, что продолжительность ферментации для других культур составила 7 ч, ферментированные образцы показали значительное различие в титруемой кислотности. Наибольший прирост содержания молочной кислоты имели образцы, ферментированные B. longum B379M и S. thermophilus (0,377% и 0,438%, соответственно), наименьшее значение B. bifidum (0,252% молочной кислоты). Результаты исследованийпоказали, что S. thermophilus и L. acidophilus утилизировать сахарозу и продуцировать значительное количество молочной кислоты.
Данные по приросту биомассы микроорганизмов (рис. 4) показывают, что при ферментировании соевой дисперсии заквасочными культурой S. thermophilus не наблюдались статистические различия при подсчетах микроорганизмов до и после ферментации. Наибольший прирост биомассы продемонстрировали L. bulgaricus, B. longum B379M и B. bifidum и составил, 0,91, 0,80 и 0,81 КОЕ/мл, соответственно. В других исследованиях показано, что S. thermophilus демонстрирует более высокий прирост биомассы, чем L.delbrueckii ssp. bulgaricus в процессе ферментации.Таким образом, рост пробиотических микроорганизмов зависит не только от способности пробиотических микроорганизмов к протеолизу, но и от штамма микроорганизмов.
Можно предположить, что благодаря наличию полифенолов и составу соевого белка, соевое молоко является подходящим субстратом для роста этих микроорганизмов.
Штамм P. schermanii КМ-186 также показал незначительный прирост биомассы микроорганизмов в процессе ферментации, что, возможно, связано с его недостаточной способностью утилизировать источники углерода или азота в соевой дисперсии. Возможно, для P. schermanii КМ-186 необходимые питательные вещества находятся в трудноусвояемой форме или в недостаточном количестве. Таким образом рост штамма ограничен доступностью питательных веществ. Предположение основано на том, что микроорганизмы Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii обычно используются совместно с молочнокислыми бактериями, так как последние могут обеспечить P. schermanii необходимым небелковым азотом за счет своей протелитической активности, а также молочной кислотой и другими углеводами, необходимыми для значительного прироста биомассы.
Как отмечает P. freudenreichii CIRM–BIA 129 также не проявляет способность к росту в соевом молоке, но рост происходил при внесении дополнительной культуры L. plantarum, которая способна высвобождать необходимые аминокислоты из соевого белка.
Результаты исследований изменения антиоксидантной активности соевых дисперсий до и после ферментации, а также в процессе хранения (рис. 4) показали, что наибольшее увеличение данного показателя в 1 день продемонстрировали образцы, ферментированные Lb. bulgaricus (49,53%) и P. shermanii KM-186 (49,02%), по сравнению с неферментированной соевой дисперсией (39,01%), сохранившие стабильные значения на протяжении двухнедельного хранения, по сравнению с другими образцами. Наименьшую антиоксидантную активность после ферментации проявили L. acidophilus 57S и S. thermophilus (41,44% и 42,77, соответственно).
Штамм L. acidophilus 57S показал стабильные значения в процессе хранения до 12 дня, в то же время S. thermophilus показалнезначительное увеличение антиоксидантной активности на 8% на протяжении срока хранения. Повышение антиоксидантной активности в ферментированных продуктах на основе соевых бобов может происходить за счет увеличения концентрации биоконвертированных изофлавоновых агликонов в процессе ферментации.
Выводы
В настоящем исследовании были изучены перспективы использования соевых дисперсий в качестве основного субстрата для ферментации штаммами бактерий Lactobacillus, Bifidobacterium и Propionibacterium.
Было показано, что продолжительность ферментации зависит от рода, рода и штамма бактерий и составляет от 6 до 8 часов.
В целом, все выбранные микроорганизмы адаптировались к растительному сырью в процессе ферментации, но наибольший прирост биомассы был выявлен при использовании L. bulgaricus, B. longum B379M и B. bifidum. Результаты измерений антиоксидантной активности показали, что применение всех видов микроорганизмов позволяет сохранить стабильные значения в процессе хранения.
Таким образом, показана перспективность использования пробиотических микроорганизмов производства ферментированных напитков на основе соевой дисперсии.
При этом необходимы дальнейшие исследования определения некоторых физико-химических характеристик, таких как реологических свойств и органолептической оценки полученных образцов, что является основой будущих исследований.
Об авторах
Наталья Владимировна Яковченко, кандидат технических наук, доцент факультета биотехнологий, старший научный сотрудник,
nviakovchenko@itmo.ru; https://orcid.org/0000-0002-5188-5916
Мария Александровна Анцыперова, кандидат технических наук, заведующий лабораторией, младший научный сотрудник, преподаватель факультета биотехнологий,
antsyperova@itmo.ru; https://orcid.org/0009-0004-0005-6597
Университет ИТМО, ул. Ломоносова, 9, Санкт-Петербург, 191002, Россия
УДК 635.655+637.181 DOI: 10.32634/0869-8155-2024-380-3-149-156
Сельское хозяйство, ветеринария, зоотехния, агрономия, агроинженерия, пищевые технологии
