Влияние ультрадисперсных частиц меди и железа на микробиоценоз кишечника цыплят-бройлеров
Исследование генетического разнообразия бактериального сообщества пищеварительной системы птицы является инструментом, помогающим изучить влияние различных факторов на нормальное бактериальное сообщество кишечника птицы. Нормальный микробиоценоз кишечника птицы представлен совокупностью сообществ микроорганизмов, которые имеют определяющее влияние на процессы, протекающие в пищеварительной системе птиц. Прежде всего это процессы расщепления питательных веществ и их усвоения.
Известно, что различные бактерии используют различный субстрат. Так, Ruminococcus расщепляют сложные углеводы, например целлюлозу. Бактериальное сообщество кишечника птиц влияет на качественный и количественный состав пищевых веществ, которые будут доступны организму сельскохозяйственной птицы, одновременно оказывая влияние на морфологию стенок кишечника, обусловливая увеличение поверхности ворсинок. Нормальное бактериальное сообщество кишечника птиц обусловливает и устойчивость к различным инфекционным заболеваниям, препятствуя заселение пищеварительной системы птицы патогенными бактериями.
На сегодняшний день остро стоит вопрос об обеспечении продовольственной безопасности и о снабжении населения высококачественной продукцией сельского хозяйства, в том числе мясом птицы. При этом исследователи предлагают пересмотреть традиционные нормы кормления в части использования новых перспективных добавок, например применения ультрадисперсных частиц (УДЧ) микроэлементов. Научные данные свидетельствуют о том, что такие формы химических элементов являются более биодоступными и имеют меньшую токсичность, чем традиционно применяемые соединения в качестве кормовых добавок. Существуют многочисленные исследования о влиянии УДЧ на морфобиохимические показатели цыплят-бройлеров, однако сведений о влиянии УДЧ на метагеномное разнообразие пищеварительного тракта птицы недостаточно, что и предопределило цель работы.
Цель работы — исследование влияния ультрадисперсных частиц меди и железа на микробиоценоз кишечника сельскохозяйственной птицы.
Материалы и методы исследования
Экспериментальные исследования на цыплятах-бройлерах кросса Арбор Айкрес проведены в условиях экспериментально-биологической клиники (вивария) ФГБНУ «Федеральный научный центр биологических систем и агротехнологий Российской академии наук» в 2022 году.
В экспериментальных исследованиях в качестве источников микроэлементов были использованы модифицированные УДЧ Fe, Cu, предоставленные д-ром биол. наук Н.Н. Глущенко (Институт энергетических проблем химической физики им. В.Л. Тальрозе — подразделение Федерального исследовательского центра химической физики им. Н.Н. Семёнова Российской академии наук, г. Москва, Россия).
Материаловедческая аттестация препаратов включала электронную сканирующую и просвечивающую микроскопию на приборах JSM 7401F и JEM-2000FX (JEOL, Япония).
В ходе экспериментальных исследований УДЧ были приготовлены путем диспергирования водных смесей частиц ультразвуком (f — 35 кГЦ, N — 300 (450) Вт, А — 10 мкм) в течение 30 минут. Смешивание проводилось ступенчато.
При выполнении работы были использованы цыплята-бройлеры, которым в рацион вносились УДЧ Cu и Fe с целью изучения их влияния на микробиоценоз пищеварительной системы птицы.
Методом пар-аналогов были сформированы 4 группы по 30 цыплят-бройлеров в каждой в возрасте 7 дней.
Во время проведения исследования условия содержания и кормления были идентичны для всех групп. Исследование было проведено в течение 4 недель. Для кормления готовили полусинтетический рацион (К1), рекомендованный Scott (1969), и полусинтетический рацион (К2), дефицитный по микроэлементам, модифицированный авторами.
В рацион I опытной группы вносили УДЧ Cu в концентрации 2,5 мг/кг корма, а II опытной группы — УДЧ Fe в концентрации 2,5 мг/кг корма.
Метагеномное секвенирование содержимого слепых отростков толстого отдела кишечника проводили, как описано в работе, в ЦКП «Персистенция микроорганизмов» Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН (г. Оренбург, Россия).
Бактериальное биоразнообразие слепого отдела кишечника птицы оценивали на 42-е сутки. Для этого выделяли бактериальную ДНК путем инкубирования проб при 37 °С в течение 30 мин. в 300 мкл стерильного буфера для лизиса (20 мM EDTA, 1400 мM NaCl, 100 мM TrisHCl, pH 7,5; 50 мкл раствора лизоцима в концентрации 100 мг/мл).
Оценку чистоты ДНК проводили электрофорезом в 1,5%-ном агарозном геле с фотометрией (NanoDrop 8000, Thermo Fisher Scientific, Inc., США). Концентрацию ДНК определяли флуориметрическим методом (прибор Qubit 2.0 с высокой чувствительностью определения dsDNA, Life Technologies, США).
ДНК-библиотеки для секвенирования были созданы по протоколу Illumina, Inc. (США) с праймерами S-D-Bact-0341-b-S-17 и S-D-Bact0785-a-A-21 к вариабельному участку V3-V4 гена 16S рРНК (24). NGS-секвенирование выполняли на платформе MiSeq (Illumina, Inc., США) с набором реактивов MiSeq Reagent Kit V3 PE600 (Illumina, Inc., США). Полученные операционные таксономические единицы (ОТЕ) классифицировали с использованием интерактивного инструмента VAMPS и базы данных RDP. Некоторые ОТЕ выравнивали, используя алгоритм BLAST, базы данных нуклеотидных последовательностей nr/nt (National Center for Biotechnological Information, NCBI) и выравненных последовательностей генов рибосомальной РНК SILVA.
Статистическую обработку данных проводили в программе Statistica 10.0 (StatSoft, Inc., США). Результаты представлены в виде средних арифметических значений (M) и стандартных ошибок среднего (±SEM). Различия считали статистически значимыми при р £ 0,05 (t-критерий Стьюдента). При биоинформатической обработке результатов секвенирования применяли комплекс программ USEARCH v8.0.1623_win32. Обработка включала слияние парных ридов в операционных таксономических единицах, фильтрацию ридов по качеству и длине (минимальный размер — 300 п. н.), удаление химер, даблтонов и синглтонов, кластеризацию ридов в ОТЕ на уровне сходства 97%.
Полученные данные обрабатывали с помощью программы SPSS Statistics 20 (IBM, США).
Обслуживание животных и экспериментальные исследования выполняли в соответствии с «Позицией по этике использования животных в исследованиях, выполняемых при поддержке Российского научного фонда» и The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). При проведении исследований были предприняты усилия, чтобы свести к минимуму страдания животных и уменьшить количество используемых образцов (протокол от 21.05.2021 № 1).
Результаты и обсуждение
Анализируя полученные данные высокопроизводительного метагеномного секвенирования, было показано, что в образцах содержимого слепой кишки цыплят-бройлеров в группе с ПР было обнаружено 188 OTU, в группе с ПДР — 204 OTU, при внесении УДЧ Cu — 225 OTU, при внесении УДЧ Fe — 161 OTU.
В содержимом слепой кишки, по данным метагеномных исследований, были обнаружены различия в качественном и количественном составе бактериального сообщества. Так, изменения в опытных группах обнаруживались как по отношению к контролю, получавшему полусинтетический рацион, так и к контролю, получавшему дефицитный по микроэлементам рацион.
Так, по отношению к первой контрольной группе, получавшей полусинтетический рацион, в I опытной группе снизилось содержание представителей Proteobacteria (на 64,1%) и Actinobacteria (на 72,5%). Одновременно с этим повысилось содержание представителей Bacteroidetes (на 135,1%) и Firmicutes (на 93,1%).
По отношению к первой контрольной группе, получавшей полусинтетический рацион, во II опытной группе снизилось содержание представителей Proteobacteria (на 44,1%), Firmicutes (на 86,2%), Actinobacteria (на 82,5%). Одновременно с этим повысилось содержание представителей Bacteroidetes (на 108,4%).
По отношению ко второй контрольной группе, получавшей полусинтетический рацион, в I опытной группе снизилось содержание представителей Bacteroidetes (на 9,4%). Одновременно с этим повысилось содержание представителей Proteobacteria (на 108,1%), Firmicutes (более чем в 10 раз). Содержание Actinobacteria осталось без изменений.
По отношению ко второй контрольной группе, получавшей полусинтетический рацион, во II опытной группе снизилось содержание представителей Actinobacteria (на 36,3%). Одновременно с этим повысилось содержание представителей Proteobacteria (на 68,4%), Firmicutes (на 33,3%), Bacteroidetes (на 19,8%).
По сравнению с таксонами, указанными выше, оценка качественного и количественного соотношения родов может также предоставить ряд данных, указывающих на процессы, протекающие в пищеварительной системе птиц. Были зафиксированы отличия как в контрольных группах, так и при внесении УДЧ (табл. 1).
В группе, получавшей полусинтетический рацион, треть всего родового разнообразия составляли Lactobacillus, чье содержание 32,5%. Многочисленными были представители Bacteroidetes (16,4%), Alistipes (11,7%) и Faecalibacterium (10,5%). Следующий пул бактерий, чье содержание в образце колебалось от 1,4 до 2,7%, был представлен такими таксонами, как Enterobacter, Mediterraneibacter, Limosilactobacillus и Ligilactobacillus. Менее 1% было содержание таких родов, как Blautia, Merdimonas, Hydrogeniiclostridium, Rubneribacter, и других (рис. 3). Их можно охарактеризовать как минорных представителей микробиоценоза слепой кишки цыплят-бройлеров.
В контрольной группе, которая получала рацион, дефицитный по микроэлементам, наибольшее содержание было выявлено для таксона Bacteroides. По сравнению с первой контрольной группой его содержание было выше в 4,4 раза. Вторым по численности таксоном в группе К2 являлся род Alistipes, чье содержание было в 2,7 раза меньше, чем в группе К1. Содержание Lactobacillus в образце было в 7,9 раза меньше, чем в первой контрольной группе. Среди таксонов, чья численность была выше 1%, можно отметить Mediterraneibacter, Intestinomonas, Merdimonas (1,5%) и Pseudoflavonifractor.
Изучая микробиоценоз слепой кишки при даче цыплятам-бройлерам УДЧ меди, было показано, что преобладающим родом являлся Bacteroides. Его содержание было в 3,2 раза выше, чем в первой контрольной группе, и в 1,4 раза ниже, чем во второй контрольной группе. Следующим по содержанию в образце стал род Alistipes, чье содержание в 1,4 раза и 3,7 раза превосходило таковые значения при даче полусинтетического рациона и рациона, дефицитного по микроэлементам, соответственно.
По сравнению с контрольными группами при даче УДЧ меди была высока доля бактерий Enterobacter в 1,8 раза и более чем в 20 раз выше, чем в первой и второй контрольных группах, соответственно. В число бактерий с долей выше 1% вошли представители Limosilactobacillus и Intestinomonas.
При внесении в рацион цыплятам-бройлерам УДЧ железа в образцах слепой кишки, как и при даче УДЧ меди, доминировали представители Bacteroides. Их содержание было выше в 2,7 раза, чем в первой контрольной группе, и в 1,6 раза ниже, чем во второй контрольной группе, соответственно.
По отношению к группе с внесением УДЧ меди содержание Bacteroides снизилось в 1,2 раза. На втором месте по численности оказались бактерии рода Limosilactobacillus, чье содержание было выше в 8 раз и в 11,6 раза выше, чем в первой контрольной группе и группе с внесением УДЧ меди. Содержание Alistipes превосходило в 1,16 раза и в 3,1 раза таковые значения в первой и второй контрольных группах соответственно. Однако по сравнению с группой с внесением УДЧ меди содержание таксона уменьшилось в 1,2 раза. Среди таксонов, чья численность была выше 1%, стоит отметить Mediterraneibacter, Coprobacter, Weisella и Faecalibacterium.
Было отмечено, что добавление в рацион цыплят-бройлеров УДЧ меди при повышении содержания Bacteroides одновременно увеличивало накопление в теле птицы таких элементов, как кобальт (r = 0,91) и никель (r = 0,92). При этом внесение дополнительного источника железа, в качестве которого выступали УДЧ, повышение содержания Bacteroides одновременно увеличивало накопление в теле птицы таких элементов, как кальций (r = 0,57) и кобальт (r = 0,91).
Исходя из данных, можно сделать вывод, что облигатная микрофлора слепого кишечника птиц может модулировать уровень накопления химических элементов в теле птицы при внесении различных веществ. Это открывает новые перспективы в разработке технологий по управлению накоплением химических элементов в теле цыплят-бройлеров.
Обобщая представленные результаты в научной литературе, можно отметить, что схожие результаты по преобладанию таксонов (Lactobacillus, Bacteroidetes, Alistipes и Faecalibacterium) в кишечнике цыплят-бройлеров были получены в.
Согласно полученным данным, УДЧ железа позволили сохранить нормальное разнообразие пищеварительной системы птицы, что было выражено в уменьшении численности представителей семейства Enterobacteriaceae, в число которых входят представители патогенных и условно-патогенных бактерий, в то время как внесение УДЧ меди способствовало повышению численности представителей данного семейства.
При этом стоит отметить, что в контрольной группе, получавшей полусинтетическую диету, преобладали молочнокислые бактерии рода Lactobacillus. Однако во всех других группах их количество было гораздо ниже, что может быть связано с дефицитом микроэлементов.
При этом на полусинтетическом рационе численность Bacteroides была ниже, чем в других группах. Известно, что данные бактерии обладают ферментами для расщепления крахмалистых полисахаридов (например, амилазы), что указывает на более полное метаболизирование птицей легкогидролизуемых компонентов кормов. То есть внесением УДЧ меди и железа можно модулировать интенсивность и направление пищеварительных процессов. Вышесказанное справедливо и для динамики численности Alistipes в эксперименте.
Отметим, что в группах, получавших рацион К2 и УДЧ меди и железа, было снижено число бактерий рода Faecalibacterium. Данные бактерии играют ключевую роль в поддержании здоровья кишечника и являются важным регулятором экспрессии генов, воспаления, дифференцировки и апоптоза в клетках-хозяевах. Однако увеличение численности Enterobacter, которые относятся к патогенным микроорганизмам, было зафиксировано только при даче УДЧ меди, а при даче УДЧ железа отмечали снижение численности, что позволяет говорить о необходимости дальнейшего изучения возможности внесения УДЧ в рацион птицы при дефицитных рационах.
В эксперименте наблюдали увеличение численности бактерий филума Bacteroidetes при даче УДЧ, при этом известно, что данные бактерии способны стимулировать пищеварение в кишечнике, поскольку они играют фундаментальную роль в гидролизе сложных молекул до более простых.
Накопление представителями Bacteroidetes различных химических элементов может быть связано с механизмом конкурентного поглощения химических элементов.
В дальнейшем изучение корреляции накопления химических элементов с определенными таксонами бактерий может быть использовано для технологий кормления с целью коррекции минерального статуса птицы.
Выводы
Использование УДЧ меди и железа способствует изменению бактериального сообщества кишечника цыплят-бройлеров.
Таким образом, исходя из данных, можно сделать вывод, что облигатные микроорганизмы слепого кишечника птиц могут модулировать уровень накопления химических элементов в теле птицы при внесении различных веществ. Это открывает новые перспективы в разработке технологий по управлению накоплением химических элементов в теле цыплят-бройлеров.
Об авторах
Ольга Вилориевна Кван, кандидат биологических наук
kwan111@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0003-0561-7002
Елена Анатольевна Сизова, доктор биологических наук
sizova.l78@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-5125-5981
Ирина Александровна Вершинина, младший научный сотрудник
gavrish.irina.ogu@gmail.com; https://orcid.org/0000-0002-9377-7673
Федеральный научный центр биологических систем и агротехнологий Российской академии наук, ул. 9 Января, 29, Оренбург, 460000, Россия
УДК 636.5.033 DOI: 10.32634/0869-8155-2024-379-2-61-65
Сельское хозяйство, ветеринария, зоотехния, агрономия, агроинженерия, пищевые технологии
