Влияние добавок растительных масел на микробиоту рубца жвачных и течение обменных процессов в рубце в in vitro исследованиях
Одним из глобальных воздействий животноводства на окружающую среду является выброс в атмосферу метана. Метан вырабатывается в рубце археями, и эти микробы часто обнаруживаются в тесной связи с видами бактерий и простейших, которые продуцируют СH4. Однако, помимо воздействия на выбросы метана или количество метаногенных микробов, существует необходимость продемонстрировать влияние на состав микробного сообщества, переваримость питательных веществ рациона и ферментативные процессы в рубце.
Жиры добавляют в рационы жвачных животных для повышения энергетической ценности рациона.
Добавки растительных жиров также могут быть использованы для коррекции структуры микробного сообщества и управления процессами ферментации в рубце. Специфические микробные группы и их взаимодействие играют ключевую роль в некоторых аспектах животноводства, включая воздействие на окружающую среду, мясную и молочную продуктивность, эффективность использования кормов. Поэтому использование растительных масел в питании крупного рогатого скота с целью коррекции метаболических процессов представляет большой интерес. Жиры и масла снижают выработку метана в рубце, и включение их в рацион жвачных животных рассматривается как одна из наиболее перспективных стратегий смягчения воздействия парниковых газов.
В некоторых исследованиях показано, что отдельные группы бактерий в рубце могут быть вовлечены в процессы биогидрирования, хотя их вклад зависит от источника липидов, поскольку природа двойной связи может отличаться от состава жирных кислот растительных масел. Для снижения воздействия на окружающую среду и улучшения качества продукта обработка кормов (или внесение дополнительных компонентов в рацион) не должна оказывать отрицательное влияние на ключевые виды, участвующие в важнейшей задаче расщепления пищевых волокон.
Необходимо учитывать, какое влияние окажет та или иная кормовая добавка на состав микробного сообщества рубца. Баланс видов бактерий также отвечает за поддержание здорового рН рубца. Поэтому очень интересно, может ли добавление масел в рацион питания повлиять на выработку и утилизацию летучих жирных кислот (ЛЖК) и азотистых фракций.
Существует нехватка данных, характеризующих влияние пищевых добавок с маслом на виды бактерий, которые играют важную роль в некоторых аспектах животноводства, описанных ранее.
Очень часто в исследованиях по изучению влияния добавок липидов на переваримость питательных веществ в рубце не рассматривается их влияние на снижение общей переваримости, анаэробную ферментацию, синтез микробного белка, липидный обмен и сдвиги в ключевых видах микробов и структуре сообщества в целом.
Цель исследования — изучение влияния подсолнечного и рапсового масел на ферментацию рубца и таксономический состав микробного сообщества in vitro.
Материалы и методы
Объектом исследования является рубцовое содержимое, полученное от бычков казахской белоголовой породы средней массы 240–255 кг в возрасте 10–11 месяцев с хронической фистулой рубца. В условиях отдела кормления сельскохозяйственных животных и технологии кормов им. С.Г. Леушина во Всероссийском научно-исследовательском институте мясного скотоводства были сформированы кормовые смеси, в качестве биосубстрата использовали пшеничные отруби, в качестве жировых компонентов — растительные масла (подсолнечное и соевое) в дозировке 3% от СВ рациона.
Обслуживание животных и экспериментальные исследования осуществлялись в соответствии с требованиями инструкций и рекомендаций к выполнению биологических исследований. При проведении исследований были предприняты меры свести к минимуму страдания животных/ Исследования производили методом in vitro c помощью инкубатора ANKOM DaisyII (ANKOM Technology, США) (модификация D200 и D200I) по специализированной методике. В качестве дисперсионной среды была выбрана дистиллированная вода. Экспериментальные исследования производили на модели бычков с фистулой рубца (n = 3) методом латинского квадрата.
Для исследования были приготовлены: I контрольный (в качестве субстрата — пшеничные отруби) и II и III опытные образцы. В состав опытных образцов входили: II — подсолнечное масло, III — соевое масло в количестве 3% от сухого вещества (СВ) рациона.
В исследованиях использовали нерафинированное подсолнечное масло первичного холодного отжима высшего сорта ТУ 10.41.59-001-95662146-2017 (ООО «Хлебодар», Россия), нерафинированное соевое масло — СТО 40490379-001-2015 (ООО «Планета вкуса», Россия).
Образцы корма взвешивали по 500 мг и насыпали в полиамидные мешочки. Затем мешочки помещались для инкубации при температуре +39,5 °С — 48 часов в смеси буферного раствора с рубцовой жидкостью. По окончании инкубации образцы промывались и высушивались при температуре +60 °С до константного веса.
Коэффициент переваримости сухого вещества in vitro вычисляли как разницу масс образца корма с мешочком до и после инкубации по формуле:
К = (А – В)/С × 100%,
где: К — коэффициент переваримости СВ корма (%); А — исходная масса 1 (образец корма с мешочком), мг; В — масса после инкубации (образец корма с мешочком), мг; С — исходная масса 2 (образец корма без массы мешочка), мг.
Лабораторные исследования проводили в Испытательном центре коллективного пользования Федерального научного центра биологических систем и агротехнологий Российской академии наук: уровень летучих жирных кислот (ЛЖК) в содержимом рубца определяли методом газовой хроматографии на хроматографе газовом «Кристаллюкс-4000М» (СКБ «Хроматек», Россия), определение форм азота — по ГОСТ 26180-84, ГОСТ 13496.4-2019.
Микробное биоразнообразие содержимого рубца проводили с помощью MiSeq (Illumina, США) методом секвенирования нового поколения (NGS) с набором реагентов MiSeq® Reagent Kit v3 (600 cycle) в Центре коллективного пользования научным оборудованием «Персистенция микроорганизмов» (Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН).
При выделении ДНК отобранные пробы содержимого инкубировали при +37 ºС в течение 30 минут в 300 мкл стерильного буфера для лизиса (20 мM EDTA, 1400 мM NaCl, 100 мM Tris-HCl, pH 7,5; 50 мкл раствора лизоцима в концентрации 100 мг/мл). К смеси добавляли 10 мкл протеиназы К (Thermo Fisher Scientific, Inc., США) в концентрации 10 мг/мл и SDS до конечной концентрации 1,0% и инкубировали в течение 30 минут при +60 ºС. ДНК очищали смесью фенола и хлороформа (1:1), осаждали добавлением ацетата натрия (3 М до 10% по объему) и трех объемов абсолютного этанола при +20 ºС в течение 4 часов. После экстракции смесью фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (25:24:1) и хлороформ-изоамиловый спирт (24:1) ДНК в водной фазе осаждали 1 М ацетатом аммония (до 10% по объему) и трехкратным объемом безводного этанола в течение 12 часов при +20 ºС. Осадок ДНК отделяли центрифугированием (12 000 об/мин, 10 мин.), дважды промывали 80%-ным этанолом, сушили и растворяли в ТЕ-буфере (1 M Тris-HCl, pH 8,0 — 1 мл, 0,5 М EDTA, pH 8,0 — 200 мкл, Н2О — до 100 мл; «Евроген», Россия). Чистоту экстракции оценивали по отрицательному контролю выделения (100 мкл автоклавированной деионизированной воды). Чистоту полученных препаратов ДНК проверяли электрофорезом в 1,5%-ном агарозном геле с фотометрией (NanoDrop 8000, Thermo Fisher Scientific, Inc., США). Концентрацию ДНК измеряли флуориметрическим методом (прибор Qubit 2.0 с высокой чувствительностью определения dsDNA, Life Technologies, США.
ДНК-библиотеки для секвенирования были созданы по протоколу Illumina, Inc. (США) с праймерами S-D-Bact-0341-b-S-17 и S-D-Bact-0785-a-A-21 к вариабельному участку V3-V4 гена 16S рРНК. NGS-секвенирование выполняли на платформе MiSeq (Illumina, Inc., США) с набором реактивов MiSeq Reagent Kit V3 PE600 (Illumina, Inc., США). Классификацию полученных операционных таксономических единиц (ОТЕ) проводили с использованием интерактивного инструмента VAMPS и базы данных RDP. Некоторые ОТЕ выравнивали c помощью алгоритма BLAST, используя базы данных нуклеотидных последовательностей nr/nt и выравненных последовательностей генов рибосомальной РНК SILVA.
Для биоинформатической обработки результатов использовалась программа PEAR.
Результаты секвенирования обрабатывали с использованием пакета анализа данных Microsoft Excel 10, программного обеспечения Microsoft Office (США).
Статистическая обработка. Численные данные были обработаны с помощью программы SPSS Statistics 20 (IBM, США), рассчитывали средние (М), среднеквадратичные отклонения (±σ), ошибки стандартного отклонения (±SE). Для сравнения вариантов использовали непараметрический метод анализа. Различия считали статистически значимыми при р ≤ 0,05, р≤ 0,01, р ≤ 0,001.
Результаты и обсуждение
При и изучении жирнокислотного состава масел установлено, что различия были незначительны (табл. 1).
Переваримость СВ контрольного рациона (пшеничные отруби) составила 63%. Включение подсолнечного и соевого масел повышало переваримость СВ относительно контроля на 2,7% и 2,8% соответственно (рис. 1).
В рубцовой жидкости конечным продуктом сбраживания углеводов являются ЛЖК. При высокой интенсивности бродильных процессов в рубце больший процент поступающих углеводов подвергается расщеплению, что приводит к количественному увеличению микробиоты рубца и, следовательно, к повышению концентрации ЛЖК. В ходе исследований in vitro установлено, что уровень ЛЖК в образцах при введении жиров был различным (рис. 2). В контрольной группе был отмечен достаточно низкий уровень ЛЖК, за исключением капроновой кислоты, однако ее уровень был ниже, чем в опытных группах.
Дополнительное включение масел показало повышение уровня уксусной кислоты: в группе с использованием подсолнечного масла — на 46,8%, в группе с соевым маслом — на 51,5% относительно контроля. Уровень масляной кислоты был также выше относительно контроля на 55,6% и 60,5%, соответственно, в I и II группах. В данных группах концентрация пропионовой и валерьяновой кислот была на одном уровне с контрольными значениями, при этом уровень капроновой кислоты (также в сравнении с контролем) значительно не изменялся.
Содержание азотистых компонентов рубцовой жидкости (РЖ) является одним из показателей степени усвояемости азота корма, а также общей направленности процессов рубцового пищеварения. Отмечено, что уровень общего белка при дополнительном введении жировых компонентов значительно снижался (табл. 2): при введении подсолнечного масла — на 22,8%, соевого масла — на 25,2%. Между концентрацией общего и белкового азота выявлена прямая взаимосвязь. Белковый азот был ниже на 9,3% в I образце, на 12% во II образце (относительно контрольных значений). Концентрация небелкового азота в опытных группах была выше относительно контроля: на 5,4% — при использовании подсолнечного масла, на 7,8% — соевого масла. Уровень аммиачного и мочевинного азота в контрольной и опытной группах отличался незначительно.
Дополнительное включение подсолнечного масла в рацион показало изменение численности микроорганизмов в РЖ, но качественный состав микробиоты относительно контрольной группы изменялся незначительно. Метагеномное секвенирование РЖ контрольной группы показало наличие 12 филумов, из них 4 филума доминирующих, в частности филум Firmicutes (17,28%), Bacteroidetes (50,42%), Verrucomicrobia (13,13%), Proteobacteria (10,18%). При включении подсолнечного масла отмечено снижение численности: Firmicutes — на 13,7%, Verrucomicrobia — на 2,7%, Proteobacteria — на 14,4%. Включение соевого масла увеличивало численность Firmicutes (на 12%), Verrucomicrobia (на 4%), Proteobacteria (на 23%), Spirochaetes (на 4,9%) относительно контрольных значений. Установлено, что при введении в рацион животным дополнительных компонентов численность Bacteroidetes, напротив, была выше на 7,8% при использовании подсолнечного жира и на 10,9% при использовании соевого масла (рис. 3).
В присутствии подсолнечного масла отмечено увеличение численности представителей семейства Prevotellaceae на 5,7% относительно контроля, однако никакого прогностического признака выявлено не было.
Добавление 3% растительных масел (независимо от источника) вызывало незначительное снижение числа копий общих бактерий по сравнению с контролем. В ряде исследований in vivo сообщалось об ингибирующем действии масел на рубцовые бактерии и чистые культуры in vitro, хотя в этих случаях более высокая доза, возможно, способствовала большему эффекту. Общее бактериальное разнообразие и обилие согласуются с результатами ферментации рубца. Переваримость СВ в рубце и общая продукция ЛЖК были увеличены добавлением масел в рацион. Добавление жира в рационы жвачных животных ранее было связано со снижением переваримости корма. Этот эффект был объяснен изменениями в микробных сообществах, снижением ферментативной активности или ограничением доступа микробов и ферментов к частицам корма из-за физического покрытия.
В исследовании бактериальные группы, участвующие в переваривании рациона, существенно не модифицировались. Представители семейства Ruminococcасеае показали небольшое увеличение числа копий: на 0,4% — при включении подсолнечного масла, на 1% — при включении соевого масла (р ≤ 0,05). Следовательно, добавление масел в дозах, использованных и в данном эксперименте, оказывало позитивное влияние на переваримость СВ в рубце. Количество и источник добавленного липида могут объяснить несоответствие эффектов добавления масла на численность бактерий и переваримость в рубце, наблюдаемых в данном исследовании, с другими, описанными в литературе. Однако некоторые исследования показали, что включение масел в дозировке 2% не изменяло переваримость органических веществ в рубце жвачных. Работы некоторых авторов показали, что включение жиров в рационы молочных коров не влияли на пищеварительный тракт в общем и переваримость СВ в рубце. Патра (2014) пришел к выводу, что усвояемость клетчатки отрицательно сказывается только при добавлении жира в рацион жвачных в высоких концентрациях. Также в согласии с данным исследованием отмечено увеличение концентрации ЛЖК в рубцовой жидкости при использовании в рационе различных источников масла.
В целом, всесторонне рассматривая все данные, было бы разумно предположить, что влияние добавок масла на переваримость кормов не имеет большого биологического значения. Количество копий Succinovibrionaceae на примере группы протеобактерий рубца было снижено. Однако было несколько исключений, когда представители Prevotellaceae и Lachnospiraceae, по-видимому, получали выгоду от добавления масла. Эти универсальные в питательном отношении группы, возможно, смогли расширить свою нишу в результате общего сокращения численности других видов.
Группы бактерий Butyrivibrio включают виды, которые связаны с биогидрированием ненасыщенных жирных кислот. В исследованиях in vivo численность Butyrivibrio после добавления растительных масел незначительно снижалась, что согласуется с нашим исследованием, при добавлении подсолнечного масла численность данного представителя снижалась на 54,5% при добавлении соевого масла на 27,3% (р ≤ 0,05). Очевидно, что существуют значительные различия между животными в реакции микробов рубца на пищевое масло.
Количество копий Streptococcus bovis было значительно снижено при добавлении растительных масел. Являясь известным продуцентом лактата, S. bovis ассоциируется с ацидозом у жвачных животных домашнего скота часто в ответ на кормление высококонцентрированными рационами. Уменьшая размножение этой микробной группы с добавлением в рацион масел, можно исправить такое состояние. Введение подсолнечного масла снижало численность представителей данного рода на 42,7% (р ≤ 0,05), соевого масла — на 44,4% (р ≤ 0,05).
Влияние добавок масла на профиль летучих жирных кислот в рубцовом содержимом зависит от типа и количества добавляемого масла, а также от диеты, в которую оно включено. Добавление растительных масел в соответствующей дозе теоретически может способствовать производству более здоровых продуктов при условии, что это не сопровождается общим снижением синтеза жира.
Выводы
В исследованиях in vitro было показано, что существует реальный потенциал для корректирования метаболических процессов и структуры бактериального сообщества в рубце путем добавления растительных масел. Равновесие различных групп микробного сообщества может, в свою очередь, способствовать ряду важных аспектов животноводства, описанных ранее. Влияние растительных масел на микробное сообщество было отражено в активности производства ЛЖК и различных форм азота со значительным сдвигом в сторону производства ацетата и бутирата и повышения концентрации небелкового азота. Кроме того, отмечено увеличение переваримости СВ рациона на 2,7–2,8% при включении растительных масел. Увеличение численности в РЖ представителей филума Bacteroidetes в опытных группах относительно контроля на 7,8–10,9%, являющихся нормофлорой рубца жвачных и участвующих в синтезе уксусной кислоты, способствовало повышению уровня уксусной и масляной кислот в группе с использованием подсолнечного масла на 46,8% и 55,6% соответственно, в группе с соевым маслом — на 51,5% и 60,5% относительно контроля.
Об авторах
Елена Владимировна Шейда, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории биологических испытаний и экспертиз, Федеральный научный центр биологических систем и агротехнологий Российской академии наук, ул. 9 Января, 2, Оренбург, 460000, Россия
Тел. +7 (922) 862-64-02
https://orcid.org/0000-0002-2586-613X; elena-shaejjda@mail.ru
Виталий Александрович Рязанов, кандидат сельскохозяйственных наук, научный сотрудник отдела кормления сельскохозяйственных животных и технологии кормов им. С.Г. Леушина, Федеральный научный центр биологических систем и агротехнологий Российской академии наук, ул. 9 Января, 2, Оренбург, 460000, Россия
Тел. +7 (3532) 43-46-79
https://orcid.org/0000-0003-0903-9561; vita7456@yandex.ru
Галимжан Калиханович Дускаев, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник отдела кормления сельскохозяйственных животных и технологии кормов им. С.Г. Леушина, Федеральный научный центр биологических систем и агротехнологий Российской академии наук, ул. 9 Января, 2, Оренбург, 460000, Россия
Тел. +7 (3532) 30-81-70
https://orcid.org/0000-0002-9015-8367; gduskaev@mail.ru
Шамиль Гафиуллович Рахматуллин, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отдела кормления сельскохозяйственных животных и технологии кормов им. С.Г. Леушина, Федеральный научный центр биологических систем и агротехнологий Российской академии наук, ул. 9 Января, 2, Оренбург, 460000, Россия
Тел. +7 (922) 815-72-25
https://orcid.org/0000-0003-0143-9499; shahm2005@rambler.ru
Ольга Вилориевна Кван, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отдела кормления сельскохозяйственных животных и технологии кормов им. С.Г. Леушина, Федеральный научный центр биологических систем и агротехнологий Российской академии наук; ул. 9 Января, 2, Оренбург, 460000, Россия
Тел. +7 (922) 548-56-57
https://orcid.org/0000-0003-0561-7002; kwan111@yandex.ru
УДК 636.084.1:636.085.57 DOI: 10.32634/0869-8155-2023-371-6-58-64
Сельское хозяйство, ветеринария, зоотехния, агрономия, агроинженерия, пищевые технологии
