Верификация тест-системы для выявления антител к вирусу диареи крупного рогатого скота иммуноферментным методом «ВД КРС — СЕРОТЕСТ плюс»
Развитие промышленного животноводства в Российской Федерации обострило проблему респираторно-кишечной патологии, особенно у молодняка крупного рогатого скота. Ежегодно по этой причине гибнут до 40% телят в возрасте от одного до шести месяцев. Одним из факторов больших экономических потерь в животноводстве является широкое распространение вируса вирусной диареи крупного рогатого скота (ВД КРС). Экономический ущерб складывается из снижения удоя у коров, потери продуктивности, гибели новорожденного молодняка, рождения нежизнеспособного потомства, развития различных форм пневмоний, нарушения функции воспроизводства животных, а также из значительных расходов на проведение лечебных, профилактических, карантинных и ликвидационных мероприятий. Также вирус вирусной диареи является сильнейшим иммуносупрессором.
Важнейшей задачей в недопущении распространения этой инфекции остается своевременная постановка диагноза, который устанавливают на основании эпизоотологических, клинических, патологоанатомических и лабораторных исследований.
Одним из методов диагностики вирусной диареи ВД КРС является иммуноферментный анализ (ИФА). «Золотым стандартом» для диагностики болезни остается реакция нейтрализации (РН) в культуре клеток. Однако данный метод требует больших трудозатрат и используется в основном в научно-исследовательских институтах.
Специалисты ВНИИЗЖ на регулярной основе проводят испытания диагностических тест-систем, представленных на российском рынке.
Материалы и методы
Выявление антител к вирусу ВД КРС методом ИФА проводили в 2023 году тест-системой «ВД КРС — СЕРОТЕСТ плюс» производства ООО «Ветбиохим» (г. Москва, Россия) согласно инструкции производителя.
В рамках выполнения данной работы проведена верификация тест-системы для выявления антител к ВД КРС иммуноферментным методом «ВД КРС — СЕРОТЕСТ плюс» по критериям чувствительность, специфичность, повторяемость, воспроизводимость.
Верификацию тест-системы проводили в соответствии с рекомендациями МЭБ.
Реакцию нейтрализации ставили согласно методическим рекомендациям. РН проводили в перевиваемой культуре клеток ПТ-80 (почка теленка) с рабочей дозой 300-350 ТЦД50/мл. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча и выражали в lg ТЦД50/мл. Исходный титр вируса составлял 5,5 lgТЦД50/мл. За диагностический титр принимали разведение сыворотки 1:16 и выше.
Критерий повторяемости определяли с помощью одного оператора в пяти параллельных исследованиях на одном и том же оборудовании.
Прецизионность в условиях воспроизводимости проводили в разные дни на одном оборудовании двумя операторами.
Чувствительность тест-системы устанавливали, используя референтные сыворотки крови производства фирмы IDvet (Франция), содержащие антитела к вирусу ВД — А1, А2, А3.
Специфичность определяли с референтными сыворотками крови КРС производства фирмы IDvet (Франция), не содержащими антитела к вирусу ВД — А4, А5 (сыворотка крови, содержащая антитела к вирусу инфекционного ринотрахеита КРС).
Также исследовали 1000 полевых образцов сыворотки крови КРС, из которых 360 проб не содержат антитела к ВД КРС, но положительные к другим респираторно-кишечным инфекциям, и 640 проб от инфицированных вирусом ВД КРС и вакцинированных животных, ранее проверенных референтными методами ВОЗЖ (Всемирная организация здоровья животных) и в реакции РН.
Для оценки прецизионности в условиях повторяемости и воспроизводимости вычисляли стандартное отклонение SD (или S) и коэффициент вариации CV по следующим формулам:
CV = S/X ̅ × 100%,
где X ̅— среднее арифметическое значение всех определений, S — стандартное отклонение, n — общее число измерений.
Провели сравнение полученных результатов исследования сывороток крови методами РН и ИФА. Определили сопоставимость результатов исследования 1000 проб сывороток крови по расчету диагностической чувствительности.
ДЧ = ИП / (ИП+ЛО) х 100%,
где ДЧ — диагностическая чувствительность, ИП — истинно положительные результаты теста, ЛО — ложноотрицательные результаты теста.
Диагностическую специфичность рассчитывали по формуле:
ДС = ИО / (ИО+ЛП) х 100%,
где ДС — диагностическая специфичность, ИО — истинно отрицательные результаты теста, ЛП — ложноположительные результаты теста.
Результаты и обсуждение
Для определения критериев повторяемости, воспроизводимости и специфичности (отсутствия ложноположительных результатов) для методов РН и ИФА были проведены исследования положительных референтных (А1, А2, А3) и отрицательных референтных (А4, А5) сывороток крови одним или двумя операторами в зависимости от критерия определения. Результаты исследований представлены в таблицах 1–4.
Как видно из таблицы 1, при постановке РН с заведомо положительными референтными сыворотками крови коэффициент вариации по критерию повторяемости находился в диапазоне 24,8–33,0%.
Из данных таблицы 2 видно, что при постановке РН с заведомо положительными референтными сыворотками крови крупного рогатого скота коэффициент вариации по критерию воспроизводимости находился в интервале 25,35–34,1%.
Как видно из таблицы 3, при постановке ИФА с заведомо положительными референтными сыворотками крови коэффициент вариации по критерию повторяемости находился в интервале 1,9–7,6%.
Из данных таблицы 4 видно, что при постановке ИФА с заведомо положительными референтными сыворотками крови коэффициент вариации по критерию воспроизводимости находился в интервале 6,6–11,2%.
При постановке двух референтных отрицательных сывороток крови А4 и А5 (в пяти повторах каждая) методом РН и тест-системой ИФА «ВД КРС — СЕРОТЕСТ плюс» были получены отрицательные результаты, что отвечает критерию 100%-ной специфичности.
Провели сравнение двух методов, ИФА и РН, по критериям диагностической чувствительности и диагностической специфичности. Результаты исследований 1000 полевых сывороток крови крупного рогатого скота представлены в таблице 5.
После математической обработки результатов исследований (табл. 6) ДЧ-метода РН и ИФА составила от 96,5 до 97,7% соответственно, ДС — от 95,0 до 97,0% соответственно. Полученные данные говорят о приемлемых аналитических характеристиках тест-системы «ВД КРС — СЕРОТЕСТ плюс» для выявления антител к ВД КРС иммуноферментным методом.
Выводы
Тест-система ИФА для выявления антител к ВД КРС «ВД КРС — СЕРОТЕСТ плюс» показала приемлемые аналитические характеристики.
По критериям повторяемости, воспроизводимости получены следующие результаты: коэффициент вариации составил от 1,9 до 7,6% и от 6,6 до 11,2% соответственно. Рассчитанное значение стандартного отклонения, выраженного в процентах, не выше задаваемых параметров. Методика соответствует требованием верификации по внутрилабораторной прецизионности.
При проверке критерия специфичности с двумя отрицательными референтными и 360 полевыми образцами сыворотки крови получены отрицательные результаты, что свидетельствует о специфичности данной тест-системы.
Таким образом, тест-система ИФА позволяет отличать гомологичные антитела от гетерологичных и может быть рекомендована для использования в лабораторной практике для выявления антител к вирусу ВД КРС после утверждения в установленном порядке.
Об авторах
Вера Владимировна Михайлова, младший научный сотрудник отдела вирусологии
vera.mihaylova.74@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-9325-7299
Татьяна Петровна Лобова, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отдела вирусологии
t.lobova@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-9167-2317
Мария Сергеевна Шишкина, младший научный сотрудник отдела вирусологии
m.belyaeva@rambler.ru; https://orcid.org/0000-0002-6930-5043
Анастасия Николаевна Скворцова, младший научный сотрудник отдела вирусологии
nefedovi5748@gmail.com; https://orcid.org/0000-0003-3071-0225
Федеральный центр охраны здоровья животных, ул. Оранжерейная, 23, Москва, 111622, Россия
УДК 619:616.98 DOI: 10.32634/0869-8155-2024-379-2-48-52
Сельское хозяйство, ветеринария, зоотехния, агрономия, агроинженерия, пищевые технологии
