Моделирование способа ПЦР-ПДРФ-генотипирования крупного рогатого скота по полиморфным маркерам гена iNOS
Индуцибельная синтаза оксида азота — цитоплазматический фермент, кодируемый геном NOS2 (nitric oxide synthase 2), также известным как iNOS (inducible nitric oxide synthase), локализованным в 19-й хромосоме у крупного рогатого скота. Данный фермент катализирует выработку реактивного азотного промежуточного продукта оксида азота — RNINO (от англ. Reactive Nitrogen Intermediate Nitric Oxide), являющегося одной из токсичных молекул иммунной системы, задействуемых при подавлении микробных патогенов.
Полиморфизм гена iNOS Bos taurus и его ассоциативная связь (как с резистентностью крупного рогатого скота к лейкозу, так и с племенной ценностью по показателям молочной продуктивности) — актуальный предмет исследования генетико-селекционной направленности.
Одним из стандартизированных подходов к определению генетического полиморфизма является метод, основанный на анализе полиморфизма длин рестрикционных фрагментов амплифицированной ДНК — ПЦР-ПДРФ. На базе данного метода уже разработаны способы генотипирования крупного рогатого скота по аллельным вариантам полиморфного маркера AH13-1 гена iNOS, притом что в анализируемом локусе рассредоточены и другие SNP-маркеры, детекция которых может быть также диагностически значима в случае установления и их взаимосвязи с хозяйственно ценными признаками.
Цели исследования — выявление и картирование полиморфных сайтов рестрикции у 4 SNP-маркеров (AH13-1, AH13-2, AH13-3, AH13-4) гена iNOS Bos taurus с последующим ПЦР-ПДРФ-профилированием встречаемых генотипов и моделированием способа генотестирования крупного рогатого скота по перечисленным полиморфным маркерам анализируемого локуса.
Материалы и методы исследования
Исследование проведено в лаборатории лейкозологии Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук в 2023 г.
Теоретико-аналитическая часть биоинформационного исследования, посвященная выявлению и картированию полиморфных сайтов рестрикции у 4 SNP-маркеров (AH13-1, AH13-2, AH13-3, AH13-4) гена iNOS Bos taurus, а также последующему ПЦР-ПДРФ-профилированию встречаемых генотипов, выполнена в онлайн-программе NEBcutter V2.0 (New England Biolabs, США).
Для практической реализации экспериментальной части исследования потребуются дальнейшие технологические процедуры выделения ДНК, постановки ПЦР и ПДРФ, а также гель-электрофорезной детекции. При этом экстракция нуклеиновых кислот из цельной консервированной крови крупного рогатого скота может быть осуществлена комплектом реагентов для выделения ДНК из клинического материала «ДНК-сорб B» (Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва, Россия).
Постановка ПЦР с праймерами iNOS-F и iNOS-R для амплификации локуса гена iNOS Bos taurus длиной 258 bp может быть проведена набором реагентов Encyclo Plus PCR kit (ЗАО «Евроген», Россия) согласно составленному ПЦР-протоколу (табл. 1).
Последующую процедуру эндонуклеазного расщепления амплифицированных ПЦР-проб следует выполнить с 4 подобранными рестриктазами (New England Biolabs, США) согласно составленным ПДРФ-протоколам (табл. 1).
Результаты и обсуждение
Ограниченная праймерами iNOS-F и iNOS-R референсная нуклеотидная последовательность локуса гена iNOS Bostaurus, депонированная в GenBank NCBI (AF465168), представлена 4 SNP-маркерами: AH13-1, AH13-2, AH13-3, AH13-4, полиморфные позиции которых обозначены на рисунке 1. При этом полиморфные позиции перечисленных SNP-маркеров могут быть успешно детектированы методом ПЦР-ПДРФ-анализа, что вполне обосновано результатом картирования полиморфных сайтов рестрикции и последующего профилирования встречаемых генотипов (рис. 1).
In silico моделирование генерируемых ПЦР-ПДРФ-профилей встречаемых генотипов полиморфных маркеров гена iNOS Bos taurus — действенный инструмент визуализации результата компьютерной симуляции эксперимента, способствующий прогнозированию применимости разрабатываемого способа генотестирования.
На рисунке 2 представлен результат in silico моделирования HinfI-ПЦР-ПДРФ-профилей генотипов полиморфного маркера AH13-1 гена iNOS Bos taurus.
Рассчитанные HinfI-ПЦР-ПДРФ-фрагменты ассоциированы с тремя генотип-специфичными профилями SNP-маркера AH13-1, среди них два гомозиготных профиля генотипов CC (192/66 bp) и TT (258 bp), а также гетерозиготный профиль генотипа CT (258/192/66 bp) (рис. 2)
Генерация данных фрагментов и ассоциированных с ними профилей опосредована полиморфной позицией маркера AH13-1 в положении 70, приводящей к созданию участка узнавания рестриктазы HinfI (G/ANTC) при SNP с заменой тимина (T) на цитозин (C) (рис. 1).
Результат моделирования in silico Sau96I-ПЦР-ПДРФ-профилей генотипов полиморфного маркера AH13-2 гена iNOS Bos taurus представлен на рисунке 3.
Sau96I-ПЦР-ПДРФ-фрагменты, ассоциированные c тремя генотип-специфичными профилями SNP-маркера AH13-2, формируют два профиля гомозиготных генотипов AA (202/47/9 bp) и GG (113/89/47/9 bp), а также профиль гетерозиготного генотипа AG (202/113/89/47/9 bp) (рис. 3). Генерация указанных фрагментов и ассоциированных с ними профилей связана не только с наличием полиморфной позиции у маркера AH13-2 в положении 114, приводящей к образованию сайта рестрикции Sau96I (G/GNCC) при SNP с заменой аденина (A) на гуанин (G), но и присутствием двух мономорфных сайтов рестрикции в анализируемом локусе гена iNOS (рис. 1).
На рисунке 4 представлен результат in silico моделирования HpyAV-ПЦР-ПДРФ-профилей генотипов полиморфного маркера AH13-3 гена iNOS Bos taurus.
Рассчитанные HpyAV-ПЦР-ПДРФ-фрагменты формируют три генотип-специфичных профиля маркера AH13-3, к которым относятся два гомозиготных профиля генотипов AA (146/112 bp) и GG (258 bp), а также гетерозиготный профиль генотипа AG (258/146/112 bp) (рис. 4). Генерация данных фрагментов и ассоциированных с ними профилей непосредственно связана с полиморфной позицией маркера AH13-3 в положении 152, приводящей к созданию участка узнавания рестриктазы HpyAV (CCTTC(6/5) при SNP с заменой гуанина (G) на аденин (A) (рис. 1).
Результат in silico моделирования MluCI-ПЦР-ПДРФ-профилей генотипов полиморфного маркера AH13-4 гена iNOS Bos taurus представлен на рисунке 5.
MluCI-ПЦР-ПДРФ-фрагменты, ассоциированные c тремя генотип-специфичными профилями SNP-маркера AH13-4, формируют два профиля гомозиготных генотипов AA (228/30 bp) и GG (258 bp), а также профиль гетерозиготного генотипа AG (258/228/30 bp) (рис. 5).
Генерация указанных фрагментов и ассоциированных с ними профилей опосредована полиморфной позицией маркера AH13-4 в положении 230, приводящей к образованию сайта рестрикции MluCI (/AATT) при SNP с заменой гуанина (G) на аденин (A) (рис. 1).
Следует отметить, что из четырех подобранных эндонуклеаз рестрикции (HinfI, Sau96I, HpyAV и MluCI), упомянутых в данной работе, две могут быть успешно заменены на их прототипы, в частности Sau96I на изошизомер AspS9I и MluCI на изошизомер Sse9I. При этом данные изошизомеры и рестриктазу HinfI производит и реализует российская компания ООО «СибЭнзайм», что ожидаемо положительно скажется на себестоимости планируемой экспериментальной части исследования.
Выводы
Результат картирования выявленных полиморфных сайтов рестрикции и последующего профилирования встречаемых генотипов свидетельствовал о возможности детектирования полиморфных позиций 4 SNP-маркеров (AH13-1, AH13-2, AH13-3, AH13-4) гена iNOS Bos taurus методом ПЦР-ПДРФ-анализа. Установленная возможность открыла путь к моделированию способа генотестирования крупного рогатого скота по перечисленным полиморфным маркерам анализируемого локуса, предусматривающего последовательные этапы экстракции нуклеиновых кислот, постановки ПЦР и ПДРФ, а также гель-электрофорезной детекции. При этом доступность отобранных эндонуклеаз рестрикции, в том числе к приобретению их изошизомеров на отечественном (российском) рынке, делает планируемую экспериментальную часть исследования вполне осуществимой.
Об авторах
Рамиль Ришадович Вафин, доктор биологических наук, профессор РАН, научный консультант
vafin-ramil@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-0914-0053
Хамид Халимович Гильманов, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
gilmanov.xx@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-7053-6925
Павел Николаевич Шастин, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник
shastin.pasha@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0001-7360-927X
Анастасия Владимировна Супова, младший научный сотрудник
supova.nastya@yandex.ru; http://orcid.org/0000-0003-0728-538X
Федеральный научный центр — Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук, Рязанский пр-т, 24, Москва, 109428, Россия
УДК: 577.2.0:636.082.2 DOI: 10.32634/0869-8155-2024-379-2-66-70
Сельское хозяйство, ветеринария, зоотехния, агрономия, агроинженерия, пищевые технологии
