Исследование полиморфизма гена тиреоглобулина у коров костромской и черно-пестрой пород Костромской области
В настоящее время одной из приоритетных задач молочного скотоводства в России является увеличение производства молока и молочных продуктов, а также повышение их качества. Как известно, молочная продуктивность коров обусловлена рядом паратипических факторов, однако немаловажную долю влияния на реализацию продуктивного потенциала оказывает генотип животного. В связи с этим в последние два десятилетия нарастающую популярность приобретает маркер-ориентированная селекция (MAS) крупного рогатого скота, основанная на применении генетических маркеров хозяйственно ценных признаков. Одним из таких генов-кандидатов является ген одноименного прогормона щитовидной железы — тиреоглобулина (TG).
Белок тиреоглобулин выполняет функцию хранения йода в организме. Он вырабатывается в организме постоянно и хранится в фолликулах щитовидной железы в виде коллоида, участвуя в цикле синтеза трийодтиронина (Т3) и тироксина (Т4). Эти гормоны оказывают непосредственное влияние на дифференциацию клеток, рост, развитие и обмен веществ организма.
Реализация наследственной информации прогормона обусловлена геном, расположенным на центромерном конце 14-й хромосомы крупного рогатого скота (КРС).
По данным многих авторов, существует однонуклеотидная замена TG, которая ассоциирована с изменением качественного и количественного состава жировой ткани животного. Ввиду этого, а также на основании исследований локусов количественных признаков (QTL), проведенных на молочных породах КРС, учеными считается, что полиморфизм TG связан с мраморностью мяса и жирномолочностью коров. Кроме того, существуют сведения об ассоциативных связях разных генетических вариантов TG с продуктивным долголетием.
В большинстве представленных в открытом доступе научных публикаций для амплификации полиморфных участков гена TG использована рестриктаза BstXI. Гомозиготному генотипу ТТ соответствуют фрагменты 473/75 п. н., гетерозиготному генотипу ТС — 473/295/178/75 п. н., гомозиготному генотипу СС — 295/178/75 п. н.
Наиболее перспективным (по данным многих исследований) является T-аллель гена TG. Ввиду этого положительный эффект проявляется тогда, когда животное является носителем гомозиготной формы аллеля TGT, в связи с чем генотип TGТТ может являться маркером молочной продуктивности и высокой жирномолочности.
Однако данный генетический вариант имеет достаточно низкую частоту встречаемости. Так, в работе Л.Ф. Давлетовой (2015 г.) установлено, что частота аллеля T у коров разных линий черно-пестрой породы находилась на сравнительно низком уровне (0,210–0,340), как и гомозиготного генотипа TT (0,060–0,138). Л.Ф. Давлетовой с соавт. (2016 г.) и другими учеными также сообщается, что частота встречаемости аллеля TGT у коров черно-пестрой породы была на уровне 0,280, а гомозиготного генотипа TGTT — 0,094.
По данным С.В. Тюлькина с соавт. (2019 г.), у коров черно-пестрой породы также отмечалась низкая частота аллеля TGT (0,160), при этом носителей гомозиготной формы данного аллеля выявлено не было.
У чистопородных коров костромской породы популяции Ивановской области частота аллельного варианта Т находилась на чрезвычайно низком уровне (0,007), при этом частота генотипа ТТ составляла 0,011, тогда как в группе коров с прилитием крови улучшающей швицкой породы аллель T фиксировался значительно чаще — 0,388, а генотип TT — 0,213.
Противоположный аллельный вариант TGСС при своей высокой распространенности в популяциях КРС является менее желательным для селекции ввиду низкой значимости для молочной продуктивности. Так, в стаде коров черно-пестрой породы в исследованиях Е.О. Крупина (2018 г.) частота встречаемости генотипа TGCC составляла 0,617 благодаря высокой концентрации аллельного варианта TGC (0,802).
С.В. Тюлькиным, Х.Х. Гильмановым и др. (2019 г.) отмечалась более высокая частота генетического варианта TGCC (0,721) среди коров черно-пестрой породы.
И.Ю. Долматовой с соавт. (2020 г.) на большой выборке (n = 379) генотипированных по TG черно-пестрых коров было установлено преобладание аллеля C (0,700), что также обусловливало высокую встречаемость генотипа CC — 0,490.
Среди чистопородных коров костромской породы, исследованной П.В. Ларионовой, генотип СС регистрировался у абсолютного большинства (0,988) на фоне высокой концентрации аллеля C (0,993). Однако в группе коров с долей крови 50%, улучшающей по швицкой породе, регистрировалась относительно меньшая частота гомозиготного генотипа CC (0,612) с частотой аллеля C 0,787.
При определении ассоциативных связей разных генотипов гена тиреоглобулина с продуктивными показателями коров разных популяций отечественными учеными выявлена ассоциация TGCT с жирномолочностью.
По сообщению Л.Ф. Давлетовой с соавт. (2016 г.), коровы черно-пестрой породы, имеющие в своем геноме аллельный вариант TGCT, обладали в сравнении с TGCC более высокими удоями (на 179 кг, или на 4%) и жирномолочностью (на 0,06%).
И.Ю. Долматовой с соавт. (2020 г.) на КРС черно-пестрой породы установлено, что носители генотипа TGTT отличались высоким удоем относительно коров генотипа TGCC — на 254,6 кг (на 5,5%, р < 0,05), массовой долей жира молока — на 0,09%. По сравнению TGCT с TGCC первые имели преимущество по удою (на 185,6 кг, или на 4,2%) и МДЖ (на 0,06%).
В исследованиях И.П. Степанова (2022 г.), проведенных на черно-пестрой породе, сообщалось, что носители генотипа TGCT превосходили сверстниц с TGCC по удою на 294 кг (или на 7,1%, р < 0,01), по МДЖ на 0,09% (р < 0,01), по МДБ на 0,01%.
В ряде научных работ Ф.Ф. Зиннатова и Ф.Ф. Зиннатовой с коллегами (2023 г.), а также других ученых отмечается схожая динамика показателей молочной продуктивности животных черно-пестрой породы.
Информация о продуктивности коров костромской породы в разрезе разных генотипов гена тиреоглобулина отсутствует, что обусловливает актуальность данной работы.
Таким образом, в настоящее время накоплено достаточно много научных данных о распространенности генетических вариантов и ассоциативных связях с продуктивностью гена TG у коров отечественных пород различных популяций.
Цель работы — изучение полиморфизма гена тиреоглобулина у коров костромской и черно-пестрой пород популяций Костромской области.
Новизна исследований заключалась в определении SNP TG-методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с детекцией результатов гибридизационно-флуоресцентным способом.
Материалы и методы исследования
Исследования были выполнены в 2022–2023 гг. в научно-исследовательской лаборатории генетики и ДНК технологий регионального информационно-селекционного центра Костромской государственной сельскохозяйственной академии на племенных коровах костромской (n = 91) и черно-пестрой (n = 105) пород племенных хозяйств Костромской области.
Данные племенного и зоотехнического учета, в том числе сведения о молочной продуктивности коров, были получены с помощью ИАС «СЕЛЭКС» (Россия).
С целью получения генетического материала у коров в условиях хозяйств проводили отбор проб крови из хвостовой вены в индивидуальные вакуумные системы (Германия) с ЭДТА К2 в качестве антикоагулянта.
Манипуляции по забору крови у крупного рогатого скота (КРС) были проведены в соответствии с международными рекомендациями и российскими нормативно-правовыми документами в отношении гуманного обращения с животными.
Геномную ДНК получали сорбентным методом экстракции из образцов крови с помощью набора реактивов ПРОБА-ГС-ГЕНЕТИКА (Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Метод основан на лизисе клеток крови, сорбции нуклеиновой кислоты на носителе, отмывке от примесей и последующей элюции.
Полиморфизм гена TG (rs135751032) определяли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) с детекцией результатов гибридизационно-флуоресцентным способом.
Амплификацию образцов ДНК проводили с использованием амплификатора DTlite (Россия) по стандартной схеме, температура отжига праймеров соответствовала 61 ºС: денатурация ДНК — 80–94 ºС (7 мин.), элонгация 5 циклов — 94–61 ºС (45 с.), отжиг 45 циклов — 94–61 ºС (20 с.), 1 цикл — 61–25 ºС (30 с.), плавление праймеров 50 циклов — 25 ºС (15 с.). Плавление реализовано методом примыкающих проб. Для повышения качества и специфичности SNP-типирования применяли модифицированные типирующие зонды, маркированные двумя разными флуорофорами, и универсальный тугоплавкий зонд с гасителем флуоресценции.
В состав смеси для постановки ПЦР (на один образец ДНК) входило 5 мкл образца ДНК, 20 мкл ПЦР-смеси, 0,24 мкл 25мМ дезоксинуклеозидтрифосфата (dNTP), 10 мкл раствора полимеразы (0,5 мкл TAQ полимеразы и 9,5 мкл ПЦР-буфера). В состав ПЦР-смеси входили следующие компоненты: зонд FAM и HEX — по 0,1 мкл, зонд BHQ — 0,3 мкл, праймер rev — 0,6 мкл, праймер forw — 0,1 мкл.
TG5_for 5′-ggT gAA AAT CTT gTg gAg gCT gTA-3′
TG5_rev 5′-CAg TTC TTC CTT ggT ggC TCA gA-3′
TG5_FAM (FAM)-5′-CTT CTC CAg ggA ATC TT-3′-(P)
TG5_HEX (HEX)-5′-CTT CTC CAg ggg ATC TT-3′-(P)
TG5_BHQ1 5′-ATA CTg gAg Tgg gTA gCC TTT CC -3′-(BHQ1)
Определение генотипа проводили путем измерения уровня флуоресценции в ходе температурной денатурации дуплексов олигонуклеотидов и полученных матриц. Результаты регистрировались в режиме реального времени. У гомозиготного анализируемого образца содержался только один вариант нуклеотидной последовательности гена, то есть температура плавления для зонда, образующего совершенный (полностью комплементарный) дуплекс, была существенно выше, чем для зонда, образующего несовершенный (частично некомплементарный) дуплекс. У гетерозиготного образца, содержащего оба варианта нуклеотидной последовательности, оба варианта зондов образовывали совершенный дуплекс, поэтому температуры их плавления были практически одинаковы.
Частоту встречаемости генотипов по локусу TG рассчитывали по формуле 1.
p = m/N (1)
где p — частота встречаемости генотипа в группе, m — количество носителей определенного генотипа, N — общее число особей.
Частоту встречаемости аллельных вариантов гена TG в группах подопытных животных вычисляли по формуле 2.
p = 2nСС + nСТ/ 2N и q = 2nТТ + nСТ/ 2N (2)
где p — частота встречаемости аллеля С, q — частота встречаемости аллеля Т, nСС, nСТ, nТТ — число носителей генотипов СС, СТ и ТТ соответственно, N — общее число животных в группе.
Равномерность распределения аллелей гена TG в изучаемых группах животных и генное равновесие оценивали при помощи уравнения Харди — Вайнберга (3).
p2 + 2pq + q2 = 1 (3)
где p и q — частоты аллелей С и Т соответственно.
Обработка результатов исследований производилась в табличном процессоре МS Office Excel 2019 (США) с использованием методов биометрического анализа и расчета популяционно-генетических показателей методами F-статистики Райта. Критерием статистической значимости разности между подгруппами животных выступал t-критерий Стьюдента, уровень статистической значимости считался достигнутым при р < 0,05. Проверку гипотезы независимости распределения аллелей в подопытных группах животных осуществляли методом «хи-квадрат» (χ2), различие между наблюдаемым и ожидаемым частотным распределением считали статистически значимым при р < 0,05.
Результаты и обсуждение
В результате генотипирования по гену тиреоглобулина было выявлено следующее распределение генотипов в исследуемых выборках коров (рис. 1).
Анализ распределения генотипов по локусу гена тиреоглобулина показал, что генетический вариант TGCC на предприятии СПК «Колхоз “Родина»» у коров костромской породы регистрировался чаще остальных — 0,904. Намного реже в данном хозяйстве встречался гетерозиготный вариант TGCT — 0,096.
В СПК «Гридино» у КРС костромской породы наблюдалась похожая динамика, где генотип TGСС был детектирован у большинства исследуемых животных — 0,897, в то время как гетерозиготных коров TGCT было значительно меньше — 0,103.
Установлено, что в обоих хозяйствах не было идентифицировано особей — носителей гомозиготного генотипа TT гена тиреоглобулина, что соответствует данным раннее проведенных исследований П.В. Ларионовой с соавт. (2008 г.), где также не было выявлено носителей гомозиготной формы аллеля TGT. Вероятно, это явление обусловлено характеристикой аллелофонда данной породы или может являться следствием прилития крови улучшающей породы. Так или иначе, это требует дальнейшего изучения на крупных популяциях скота.
Таким образом, в выборке коров костромской породы на фоне низкой частоты гетерозиготного CT-генотипа (9,9%) и отсутствия носителей гомозиготной формы TT генотип CC был выявлен у подавляющей части генотипированных животных (90,1%).
У КРС черно-пестрой породы наблюдалась схожая картина распределения носителей генотипов гена TG. В стаде СПК «Расловское» фиксировалась наибольшая частота встречаемости генотипа TGCC (0,646), вместе с этим гетерозиготный генотип TGCT имел частоту встречаемости на уровне 0,323. Также в этой группе животных выявлены коровы — носители гомозиготной формы гена тиреоглобулина TGTT, однако частота его встречаемости была достаточно низкая — 0,031, что согласуется с результатами исследований других авторов.
В СПК «Яковлевское» были обнаружены только особи с аллельными вариантами TGCC и TGCT, частота встречаемости которых составила 0,775 и 0,225 соответственно.
Таким образом, в протестированном массиве коров черно-пестрой породы генотип TGCC встречался чаще (69,5%), а TGTT — реже (1,9%), при этом гетерозиготный генотип TGCT регистрировали у 28,6% животных.
Данные о распределении аллельных форм гена TG коров Костромской области приведены на рисунке 2.
По данным (рис. 2) видно, что в популяции племенного КРС костромской породы предпочтительный для селекции аллельный вариант TGT имел наиболее низкую частоту встречаемости (0,049). В то же время в черно-пестрой породе данная аллельная форма гена тиреоглобулина регистрировалась в три раза чаще (0,162). По встречаемости аллеля TGC существенной дифференциации между исследуемыми породами не установлено, в обеих популяциях отмечено его существенное преобладание над T-аллелем, что также отмечается в исследованиях П.В. Ларионовой (2005 г.), Ф.Р. Валитова (2016 г.), С.В. Тюлькина (2019 г.), И.Ю. Долматовой (2020 г.) и др.
Популяционно-генетический анализ не выявил недостатка или избытка гетерозигот: теоретически ожидаемое согласно закону Харди-Вайнберга значение было близко к практически наблюдаемому в обоих хозяйствах, что указывает на соблюдение генного равновесия по локусу TG. При этом генетических различий по локусу TG между группами животных также не наблюдалось. Это говорит об отсутствии каких-либо факторов, оказывающих давление на распространение аллелей гена тиреоглобулина в областной популяции животных костромской породы.
Результаты популяционно-генетического анализа по локусу TG для популяции черно-пестрой породы региона оказались сходными с анализом популяции костромской породы. Таким образом, распространение аллелей гена тиреоглобулина в обеих популяциях происходит свободно, вне зависимости от каких-либо ограничивающих факторов.
Фоновые показатели продуктивности коров согласно бонитировочным данным и ежегоднику ВНИИПЛЕМ приведены в таблице 1.
В ходе исследования были проанализированы показатели молочной продуктивности в разрезе лактаций у коров костромской и черно-пестрой пород с разными генотипами по гену TG (табл. 2).
Так, данные таблицы 2 соотносимы с фоновыми показателями, представленными в таблице 1. При этом анализируя сведения таблицы 2, можно заметить, что статистически значимая разность качественных показателей молочной продуктивности коров отмечалась только в старшем возрасте. При этом наилучшими показателями в большинстве случаев отличались гетерозиготы (TGCT), что согласуется с данными ряда исследований.
Так, в стаде СПК «Колхоз «Родина» у коров костромской породы по 1-й лактации установлено преобладание особей с генотипом TGCT над TGCC по удою и жирномолочности — на 63 кг и 0,04% соответственно. Группа полновозрастных коров с генотипом TGCT демонстрировала более высокие по сравнению с TGCC-генотипом удои (на 91 кг). При этом коровы с TGCC-генотипом статистически значимо превосходили носителей TGCT по жирномолочности — на 0,10% (р < 0,001). Аналогичные результаты были в племенном стаде СПК «Гридино». Одновременно с этим у половозрастных коров, имеющих в своем геноме генотип CT по локусу TG, определялось статистически значимое превосходство по массовой доле белка в молоке — на 0,14 % (р < 0,05).
В среднем в исследованном массиве животных костромской породы, как среди первотелок, так и среди половозрастных коров, просматривается тенденция к более высокому удою за лактацию, содержанию жира и белка в молоке у гетерозигот по сравнению с гомозиготными TGCC-сверстницами.
При исследовании выборки черно-пестрой породы коров выявили, что гетерозиготные первотелки СПК «Расловское» превосходили носительниц TGСС по удою (на 238 кг) и массовой доле белка (на 0,02%). Половозрастные коровы с генотипом TGCT имели более высокий удой, МДЖ и МДБ относительно сверстниц с TGCC — на 242 кг, 0,07 и 0,01% соответственно.
В стаде СПК «Яковлевское» гетерозиготные коровы TGCT также превосходили своих гомозиготных сверстниц TGCC и TGTT по содержанию жира и белка в молоке, однако по удою гетерозиготы заметно уступали носительницам генотипа TGCC, причем у половозрастных коров эта разница достигла статистически значимой величины — 1695 кг (р < 0,05).
Однако в среднем в черно-пестрой породе, как и в костромской, носительницы генотипа TGCT превосходили своих гомозиготных сверстниц по удою, содержанию жира и белка в молоке.
В целом по результатам исследований в виду редкости ТТ-генотипа гена TG не представляется возможным объективно установить его положительное влияние на молочную продуктивность, о котором сообщается исследователями. Однако просматривается тенденция к более высоким количественным и качественным показателям молочной продуктивности у носителей гетерозиготного генотипа СТ гена тиреоглобулина, что может быть обусловлено наличием в их геноме желательного Т-аллеля.
Выводы
Таким образом, в племенных стадах коров костромской и черно-пестрой пород Костромской области наблюдается численное преобладание носительниц генотипа CC и аллеля C гена тиреоглобулина. При этом генное равновесие Харди — Вайнберга соблюдено, следовательно, не обнаружено никаких препятствий к свободному распространению аллелей С и T гена TG в изучаемых популяциях КРС.
В общей массе коров, как костромской, так и черно-пестрой породы, прослеживается тенденция к более высоким показателям молочной продуктивности у гетерозиготных животных. Однако статистически значимые различия между коровами разных генотипов по локусу TG были получены только в отдельных стадах, причем характер ассоциативной связи между генотипами TG и показателями молочной продуктивности существенно отличался для каждого отдельного стада. Это указывает на необходимость изучения гена тиреоглобулина в комплексе с другими ДНК-маркерами молочной продуктивности и обмена веществ.
Кроме того, статистически значимые различия между коровами с разными генотипами TG выявлены только у половозрастных животных, что, возможно, указывает на перспективность использования данного ДНК-маркера для определения генетического потенциала продуктивного долголетия коров.
Полученные результаты могут применяться в селекционно-племенной работе с КРС Костромской области с целью отбора и подбора наиболее перспективных с точки зрения уровня продуктивности животных, а также в учебном процессе при чтении лекций и проведении практических и лабораторных работ по направлениям подготовки: 36.03.02 Зоотехния; 36.04.02 Зоотехния; 4.2.5. Разведение, селекция, генетика и биотехнология животных.
Об авторах
Александр Дмитриевич Лемякин, селекционер-зоотехник
whichspecial@gmail.com; https://orcid.org/0000-0002-7737-6351
Лада Сергеевна Баданина, магистрант
lada.badanina2017@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-1286-3714
Алексей Александрович Чаицкий, кандидат биологических наук, преподаватель
aleksei_chaitskiy@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-5853-3809
Ксения Дмитриевна Сабетова, кандидат ветеринарных наук, заведующая лабораторией генетики и ДНК-технологий
kseniyasabetova@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-3282-4779
Павел Олегович Щеголев, кандидат сельскохозяйственных наук, селекционер-зоотехник
bigboy25@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-3552-8457
Костромская государственная сельскохозяйственная академия, ул.Учебный городок, 34, Караваево, Кострома, 156530, Россия
УДК 636.082 DOI: 10.32634/0869-8155-2024-378-1-52-59
Сельское хозяйство, ветеринария, зоотехния, агрономия, агроинженерия, пищевые технологии
