Антиоксидантная активность козьего молока с вариантами множественной регрессионной модели
Статистические данные Продовольственной и сельскохозяйственной организации Объединенных Наций (ФАО) показывают, что козье молоко является третьим в мире видом молока по величине объемов производства после коровьего и буйволиного. В 2016 году во всем мире насчитывалось около 1 мрд коз. Интерес потребителей к козьему молоку и молочным продуктам на его основе постоянно растет и связан с особыми свойствами этих продуктов.
Несмотря на схожий с коровьим молоком состав по содержанию белков, жиров и лактозы, между ними существуют различия, влияющие на их усвояемость и пищевую ценность. Различия между аминокислотным составом, вторичной структурой молочных белков и химическими свойствами козьего молока помогают снизить его аллергенный потенциал по сравнению с коровьим молоком, что также делает его отличным основным продуктом питания для младенцев и пожилых людей. В этом смысле козье молоко также является отличной матрицей для разработки широкого спектра инновационных продуктов, способствующих укреплению здоровья, и функциональных пищевых продуктов.
Молоко, а также молочные продукты — неотъемлемая часть питания человека. Они считаются носителями белков «высшей» биологической ценности, кальция, незаменимых жирных кислот, аминокислот, жиров, водорастворимых витаминов и других биологически активных соединений (БАС), имеющих большое значение для ряда биохимических и физиологических процессов, в том числе антиоксидантной защиты.
Антиоксиданты — это химические вещества, которые могут нейтрализовать и удалять свободные радикалы, которые постоянно вырабатываются в организме. Живому организму для протекания биологических процессов необходимо производство энергии, которое происходит за счет окисления биомолекул. Однако окислительный стресс может нанести серьезный ущерб биологическим системам. Неконтролируемая выработка свободных радикалов в организме может привести к окислительному стрессу с последующим разрушением необходимых для жизнедеятельности биологически активных веществ, таких как белки, липиды, ДНК и пр. Это, в свою очередь, ускоряет канцерогенез, а также значительно увеличивает риск появления атеросклероза, диабета, ускоренного старения, сердечно-сосудистых заболеваний, нарушений в работе иммунной системы.
Антиоксидантная активность молока и молочных продуктов обусловлена комплексом биологически активных компонентов: витаминами А, С, Е, каротиноидами, ферментными системами, белками, пептидами, серосодержащими аминокислотами и рядом веществ небелковой природы.
Аскорбиновая кислота — один из основных водорастворимых природных антиоксидантов в составе молока. Она поглощает различные радикалы, такие как супероксидные анионные радикалы, алкоксильные радикалы и синглетный кислород, супероксид, оксид железа, оксид азота. По данным, фотоокислительная стабильность молока значительно увеличивается при добавлении витамина С и токоферола, так же как и сохранение его органолептических свойств.
Стоит отметить, что аскорбиновая кислота может быть и прооксидантом за счет регенерации перферрильного радикала в процессе инициации перекисного окисления липидов. При невысоком содержании аскорбиновой кислоты в молоке она действует как прооксидант, а при высоком (более 5 мг%) — как антиоксидант. Витамины А и Е считаются первичными липидорастворимыми антиоксидантами. Основная задача этих витаминов — в защите полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) и связанных с ними биохимических соединений от перекисного окисления. Витамин Е может ингибировать активность плазмина, а также может напрямую удалять свободные радикалы.
Каротиноиды являются жирорастворимыми соединениями, которые имеют свойство накапливаться в мембранах, а также липопротеинах. Среди различных антиоксидантных систем молока данные соединения действуют как поглотители активных форм кислорода и пероксильных радикалов. Стоит отметить, что концентрация каротиноидов в молочных продуктах, таких как сыр и масло, выше по сравнению с цельным молоком.
Ферменты. Супероксиддисмутаза (СОД) катализирует удаление супероксидных свободных радикалов (O2—) и защищает клетки от вредного воздействия с помощью следующей реакции:
2O2— + 2Н+ → Н2О2 + О2
Каталаза, глутатионпероксидаза или другие восстановители, в свою очередь, превращают H2O2 в H2O. Цитозольная Cu/Zn-СОД, митохондриальная Mn-СОД и внеклеточная EC-СОД являются основными формами СОД. СОД может ингибировать перекисное окисление липидов.
Глутатионпероксидаза (GSHPx) — селенсодержащий фермент, который обеспечивает защиту от перекисного окисления липидов. Она катализирует разложение H2O2 и органических гидропероксидов (R-OOH) глутатионом. Каталаза вызывает дисмутацию H2O2 (химическая реакция, в которой H2O2 вызывает окисление других молекул H2O2, следовательно, одна превращается в O2, а две другие — в две молекулы H2O).
Казеины, основные белки молока, также обладают антиоксидантной активностью. В антиоксидантной системе молока казеиновая фракция играет роль уловителя различных активных форм кислорода. Казеины препятствуют аутоокислению липидов.
Основной вклад в антиоксидантную активность белковой фракции молока вносят сывороточные белки. Механизм их антиоксидантной активности основан на хелатировании переходных металлов лактоферрином и удалении свободных радикалов за счет наличия серосодержащих аминокислот. Лактоферрин, связывая железо, препятствует превращению H2O2 в гидроксильный радикал. Он способен связывать и липополисахариды, что препятствует образованию из них свободных радикалов. Сывороточные белки повышают уровень глутатионпероксидазы, которая считается одной из наиболее важных водорастворимых антиоксидантных систем.
Детальный анализ перечисленных компонентов имеет высокую стоимость и не всегда целесообразен, зато их «общий фон» в пробе можно выразить через показатель суммарной антиоксидантной активности.
Цели работы — изучение антиоксидантной активности козьего молока и применение математической модели для ее оценки по данным биохимического анализа.
Материалы и методы исследования
Отбор проб козьего молока производили в Воскресенском районеМосковской области специалистами личных хозяйств в соответствии с ГОСТ 26809.1-2014. Периоды взятия образцов — июнь 2022 года (n = 18) и июнь 2023 года (n = 18). Пробы молока получали от коз альпийской породы с учетом состояния здоровья, сроков окота, возраста, длительности проживания в условиях конкретной территории.
Анализ биохимических показателей козьего молока выполнен в центре коллективного пользования научным оборудованием «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста. Аналитическая система MilkoScan 7 / Fossomatic 7 DC (Дания) и MilkoScan 7 (Foss Analytical A/S, Дания) — спектрофотометр.
Анализ суммарного количества водорастворимых антиоксидантов (СКВА) молока и молочной сыворотки выполнен по методике, описанной в работе А.А. Савиной с соавт. на приборе «ЦветЯуза 01-АА» (НПО «Химавтоматика», Россия).
Построение множественной регрессионной модели осуществляли в программе R (пакет анализа Psych) (разработчики — Росс Ихака и Роберт Гентлман, Австрия). Между ожидаемым значением СКВА молока коз и каждой из независимых переменных, в качестве которых использовали следующие данные: массовая доля жира (МДЖ), массовая доля белка истинного (МДБи), массовая доля белка общего (МДБо), казеины, лактоза, сухой обезжиренный молочный остаток (СОМО), сухое вещество (СВ), точка замерзания (ТЗ), кислотность (pH), ацетон, мочевина, бетагидроксибутират (БГБ). Существующая линейная зависимость между изучаемыми показателями позволяет вывести модель множественной линейной регрессии следующего вида:
СКВА = b0 + b1*x1 + b2x2 + … + bn*xn,
где b0 — сдвиг, b1-n — коэффициенты отклонения для переменных x1-n.
Значения коэффициентов регрессии найдены по методу наименьших квадратов.
Статистическую обработку результатов проводили в программах Microsoft Exсel при помощи пакета «Анализ данных» (Microsoft, США), R при помощи пакета Psych. Оценка достоверности различий между группами по U-критерию Манна — Уитни. При условии, что U экспериментальное ≤ U эмпирического, установленные различия считались статистически значимыми. U эмпирическое для n = 18 — 109.
Результаты и обсуждение
На рисунке 1 представлены результаты анализа антиоксидантной активности на приборе «ЦветЯуза 01-АА» в козьем молоке по данным 2022 г. (рис. 1а) и 2023 г. (рис. 1в). Средние значения показателя СКВА составили 21,99 ± 1,48 и 22,30 ± 1,91 мг/г в 2022 и 2023 гг. соответственно. Достоверных различий между пробами, полученными в июне 2022 г. и в июне 2023 г., нет (U экспериментальное — 149, z = 0,44, p = 0,362).
При построении полной регрессионной модели для вычисления СКВА в козьем молоке были учтены все данные биохимического анализа козьего молока, даже если они не оказывали существенного влияния на интересующий показатель СКВА. Таким образом, показатель значения СКВА рассчитывался как линейная комбинация параметров МДЖ, МДБи, казеинов, лактозы и т. д.
В результате построения регрессионной модели сформировано несколько регрессионных уравнений. Уравнение 1 учитывает все полученные результаты:
где МДЖ — массовая доля жира, МДБи — массовая доля белка (истинного), МДБи — массовая доля белка (общего), СОМО — сухой обезжиренный молочный остаток, СВ — сухое вещество, Л — лактоза, К — казеины, А — ацетон, БГБ — бетагидроксибутират, М — мочевина, ТЗ — точка замерзания, рН — кислотность.
Уравнение (1) имеет низкий коэффициент множественной корреляции (0,674) и незначимо по F-критерию. Кроме того, полученные коэффициенты для МДЖ, МДБи, МДБо, СОМО, СВ, лактозы, казеинов, ацетона, БГБ, мочевины, ТЗ, рН не являются значимыми по t-критерию Стьюдента, а скорректированное значение R2 принимает отрицательное значение.
Чтобы оптимизировать модель в уравнении 1, приняли константу, равную 0, и получили уравнение 2 следующего вида:
Уравнение (2) имеет высокий коэффициент множественной корреляции (0,9663) и значимо по F-критерию. Однако полученные коэффициенты для МДЖ, МДБи, МДБо, СОМО, СВ, лактозы, казеинов, ацетона, БГБ, мочевины, ТЗ, рН не являются значимыми по t-критерию Стьюдента. Тем не менее скорректированное значение R2 принимает высокое значение (0,67), что можно считать удовлетворительным результатом.
Чтобы оптимизировать и сократить полученное уравнение, провели ряд последовательных вычислений и путем подбора пришли к уравнению 3 следующего вида:
СКВА = 8,22 * K,
где К — казеины.
Уравнение (3) имеет высокий коэффициент множественной корреляции (0,947) и значимо по F-критерию. Полученный коэффициент для казеинов (р ≤ 0,001) является значимым по t-критерию Стьюдента, а скорректированное значение R2 = 0,84, что можно считать хорошим результатом.
Воспользовавшись уравнением 3, были рассчитаны значения СКВА для проб, полученных в июле 2022 г. (рис. 1б) и в июле 2023-го (рис. 1г). Средние значения при использовании регрессионной модели составили 22,00 ± 0,72 и 21,79 ± 0,71 мг/г соответственно. Статистически значимых различий между средними результатами, полученными на приборе и при использовании уравнения множественной линейной регрессии, нет. Далее проверили разницу для каждого образца между показанием СКВА прибора и СКВА, рассчитанного с использованием полученного уравнения множественной регрессии. Из 36 расчетных по формуле значений в 5 случаях разница с результатами измерения составила 5%, что сопоставимо с погрешностью измерения прибора. В среднем разница с измеренными значениями составляла приблизительно 35%.
Таким образом, полученная модель регрессионного уравнения позволяет удовлетворительно описать среднее значение СКВА в популяции изучаемых животных, однако она требует доработки, чтобы получать индивидуальный результат, сопоставимый с погрешностью измерения прибора в 5%.
Выводы
Цельное козье молоко — ценный продукт питания с антиоксидантной активностью на уровне 22,0–22,3 мг/г. Предложенная модель регрессионного уравнения (3), которая включает в себя только казеины, имеет хорошую предсказательную ценность при оценке среднего значения показателя СКВА козьего молока в группе или выборке. Полученный с ее помощью результат 22,0–21,8 ± 0,7 мг/г сопоставим со средними значениями, полученными на приборе «ЦветЯуза 01-АА».
Об авторах
Оксана Александровна Воронина, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отдела физиологии и биохимии сельскохозяйственных животных
voroninaok-senia@inbox.ru; https://orcid.org/0000-0002-6774-4288
Никита Сергеевич Колесник, младший научный сотрудник отдела физиологии и биохимии сельскохозяйственных животных
kominisiko@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-4267-5300
Анастасия Анатольевна Савина, младший научный сотрудник отдела физиологии и биохимии сельскохозяйственных животных
kirablackfire@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-0257-1643
Роман Анатольевич Рыков, старший научный сотрудник отдела физиологии и биохимии сельскохозяйственных животных
brukw@bk.ru; https://orcid.org/0000-0003-0228-8901
Сергей Юрьевич Зайцев, доктор биологических наук, доктор химических наук, профессор, ведущий научный сотрудник отдела физиологии и биохимии сельскохозяйственных животных
s.y.zaitsev@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-1533-8680
Федеральный исследовательский центр животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, пос. Дубровицы, 60, г. о. Подольск, Московская обл., 142132, Россия
УДК 636.39.034, 637.12.04/.07 DOI: 10.32634/0869-8155-2024-378-1-81-85
Сельское хозяйство, ветеринария, зоотехния, агрономия, агроинженерия, пищевые технологии
