Совершенствование технологии получения низкомолекулярного хитозана в условиях регулируемого ферментативного расщепления
Достижения биотехнологического прогресса — получение, изучение и внедрение в практику биополимеров хитозана и его производных. Особое внимание и важнейший интерес для перспективных применений хитозана представляют его низкомолекулярные формы. В промышленных масштабах такие низкомолекулярные соединения получают методом химического или ферментативного гидролиза с хорошо известными ограничениями и недостатками, присущими этим технологиям.
Вопросу гидролиза хитозана, в том числе и ферментативного, в последнее время уделяется достаточно много внимания.
Преимущества ферментативного гидролиза, который проводят в гомогенной среде, — возможность достижения большого выхода олигосахаридов и малая степень реацетилирования. Для гидролиза используют как специфический для хитозана фермент хитиназу, так и неспецифические: коллагеназу, целловиридин, трипсин, пепсин, липазу. Отмечается как сам факт проявления активности некоторых ферментов по отношению к хитозану, так и различного рода эффекты, сопровождающие данный процесс.
Применение ферментного препарата дает возможность регулировать молекулярную массу хитозана в широких пределах, изменяя такие параметры процесса, как длительность, рН и температура, но рациональным представляется регулирование молекулярной массы хитозана нормой внесения ферментативного препарата.
Некоторые из этих препаратов проявляют гидролитическую активность (такую же, как хитиназы), а ряд протеаз даже более эффективно деполимеризуют хитозан по сравнению с препаратами хитиназ. Между тем вопрос о причине воздействия неспецифических ферментов на хитозан до сих пор остается открытым. Поскольку его свойства чрезвычайно сильно зависят от молекулярной массы, поэтому изучение закономерностей гидролиза хитозана представляет актуальную проблему в связи с производством и использованием различных продуктов на их основе.
Совершенствование химических способов переработки хитинсодержащего сырья и разработка новых технологий требуют детального изучения механизмов гидролиза хитозана в кислых и щелочных условиях и установления основных закономерностей этих превращений.
Низкомолекулярный хитозан и его производные представляют значительный интерес в качестве препаратов для профилактики и лечения заболеваний, вызванных различными нарушениями иммунной системы, острыми или хроническими воспалительными процессами в организме. Поэтому исследования по созданию новых, более совершенных, экономичных и экологически безопасных технологий получения хитозана и его модификаций являются актуальными и имеют важное практическое значение.
Цели исследования —подобрать технологические параметры получения низкомолекулярного хитозана, установить достоверное снижение динамической вязкости, определить молекулярно-массовые характеристикии физико-химические показатели в опытно-промышленных сериях.
Материалы и методы исследования
Экспериментальные исследования проведены в 2022 году на кафедре диагностики болезней, терапии, акушерства и репродукции животных Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологий — МВА им. К.И. Скрябина и на базе Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности (г. Щелково, Московская обл., Россия).
Для проведения ферментативного гидролиза использовали препарат «Целловиридин Г20Х» (завод биологических препаратов, г. Бердск, Россия) на основе штамма Trichodermareesei.
Для получения новых модификаций хитозана использовали кислоторастворимый хитозан из панциря камчатского краба (ММ 700 кДа, СДА 85%), сукцинат хитозана (ММ 330 кДа, СЗ 75,2%), хитозан низкомолекулярный пищевой (гидрохлорид) (ММ 50 кДа), хитозан гелевый (2%-ный раствор в 2%-ной уксусной кислоте) («Биопрогресс», Россия.
Измерение рН проводили потенциометрическим методом, для этого использовали рН-метры, ионометры марки И-160 МИ и рН-метр MP-220 Basic pH/mV/°C (Mettler-Toledo GmbH, Швейцария).
Для проведения эксперимента были изготовлены три опытно-промышленные серии низкомолекулярного хитозана. В каждой из этих серий использовали исходный хитозан в количестве 2 кг, отличающийся по фермент-субстратному соотношению компонентов реакции: I серия — 1:100, II серия — 1:10, III серия — 1:50.
В качестве контроля использовали две пробы хитозана: К1 — исходный препарат хитозана; К2 — препарат хитозана, прошедший те же этапы технологической обработки, что и опытно-промышленные серии, но без фермента.
Определение динамической вязкости растворов модификаций хитозана — на ротационном вискозиметре Reotest-2 (RheoTest Messgerate Medingen GmbH», Германия) в системе коаксиальных цилиндров при скоростях сдвига от 3 до 1400 С-1 в соответствии с инструкцией, прилагаемой к прибору; молекулярно-массовые характеристики модификаций хитозана — на хроматографе высокого давления (Gilson, США), оснащенном инжектором Rheodyne с петлей на 200 мкл и рефрактометрическим детектором GilsonR1, колонкой TKS-GelGMPWXL 7,8 mmx 30 cm (Tosoh Bioscience, Япония).
Калибровку системы проводили по набору полиэтиленоксидных стандартов. Условия анализа: элюент — 0,2 М, уксусная кислота + ацетат натрия — 0,1 М или 0,2 М, скорость потока — 1 мл/мин, объем пробы — 50–100 мкл. Остаточную влажность образцов модифицированного хитозана — высушиванием пробы при Т = 105 °С.
Полученные результаты статистически обработаны с использованием t-критерия Стьюдента. Достоверными считали различия при р ≤ 0,05.
Результаты и обсуждение
Для изучения зависимости молекулярной массы получаемого низкомолекулярного хитозана от количества используемого фермента (фермент-субстратное соотношение) проводили при следующих параметрах: рН — 5,4, t — 55 °C, продолжительность ферментолиза — 4 часа.
В качестве контроля использовали раствор хитозана без добавления ферментного препарата.
На рисунке 1 показано, что наиболее динамичное снижение молекулярной массы происходит в интервале фермент-субстратных соотношений от 1:1000 до 1:50.
Проведение ферментативного гидролиза в течение четырех часов при фермент-субстратном соотношении 1:50 молекулярная масса хитозана снизилась практически в семь раз по сравнению с контрольным образцом, что составляет 100 кДа.
Проводимое осаждение низкомолекулярного хитозана при рН 9–10 позволяет получить выход целевого продукта на уровне 55–70%, так как самые низкомолекулярные фракции остаются в растворе и оказываются потерянными. Снижение рН до 8 при промывке осадка значительно увеличивает потери целевого продукта, так как фракции с молекулярной массой 5 кДа и ниже приобретают растворимость и теряются вместе с фильтратом.
Изучение влияния продолжительности процесса ферментолиза на молекулярную массу хитозана проводили при фермент-субстратном соотношении 1:100, рН — 5,4, t — 55 °C.
Процесс ферментолиза осуществляли в течение 4–21 часа. Каждые два часа отбирали образцы хитозана для определения динамической вязкости его раствора.
В результате исследований процесс ферментолиза замедлился через 8–10 часов, о чем свидетельствует почти полное замедление падения динамической вязкости раствора хитозана (рис. 2).
Аналогичные результаты получены и при фермент-субстратном соотношении, равном 1:10. Однако в этих условиях снижение динамической вязкости раствора хитозана было более значительным — от 679,6 сПз исходного раствора до 15,2 сПз через 21 час гидролиза, то есть достоверное снижение в 44,7 раза соответственно. Молекулярная масса полученного хитозана в этом случае составила 15–16 кДа.
Физико-химические показатели опытно-промышленных серий хитозана представлены в таблице 1.
Как видно из данных (табл. 1), наибольшее снижение динамической вязкости хитозана достоверно наблюдалось в опытно-промышленной серии II (в 29,3 раза), а опытно-промышленных серий I и III — в 6,9 и 10,6 раза соответственно. В результате ферментативного гидролиза хитозана в опытно-промышленной серии II удалось снизить молекулярную массу с 700 до 24 кДа, а в сериях I и III — до 102 и 66 кДа.
В таблице 2 представлены результаты определения молекулярно-массовых характеристик опытно-промышленных серий низкомолекулярного хитозана, определенные методом ВЭЖХ.
На основании результатов исследований разработана, апробирована и предложена для промышленного применения усовершенствованная технологическая схема получения низкомолекулярных производных хитозана методом ферментативного гидролиза, разработаны ТУ «Хитозан низкомолекулярный» (ТУ 9289-038-11734126-15).
Выводы
Показано, что при проведении процесса ферментативного гидролиза хитозана (молекулярная масса — 700 кДа, СДА — 85%, рН — 5,4, t = 55 °C, продолжительность — 4 часа) позволяет получить низкомолекулярный хитозан с молекулярной массой от 15 до 24 кДа.
Наибольшее снижение динамической вязкости хитозана достоверно наблюдалось в опытно-промышленной серии II (в 29,3 раза), а опытно-промышленных серий I и III — в 6,9 и 10,6 раза соответственно.
В результате ферментативного гидролиза хитозана в опытно-промышленной серии II удалось снизить молекулярную массу с 700 до 24 кДа, а в сериях I и III — до 102 и 66 кДа.
В результате исследований были подобраны технологические параметры получения низкомолекулярного хитозана и определены физико-химические показатели опытно-промышленных серий в процессе ферментолиза.
Об авторах
Жора Юрикович Мурадян1, кандидат биологических наук, доцент кафедры диагностики болезней, терапии, акушерства и репродукции животных
zh_muradyan@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-2516-7627
Алексей Иванович Албулов2, доктор биологических наук, профессор, заведующий отделом биологически активных веществ
info@bioprogress.ru; https://orcid.org/0000-0001-7914-4397
Роман Васильевич Рогов3, кандидат биологических наук, доцент департамента ветеринарной медицины Аграрно-технологического института
r.v.rogov@mail.ru ; https://orcid.org/0000-0002-3010-5714
1Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии — МВА им. К.И. Скрябина, ул. Академика Скрябина, 23, Москва, 109472, Россия
2Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности, пос. Биокомбината, 17, Лосино-Петровский, Москва, 141142, Россия
3Российский университет дружбы народов, ул. Миклухо-Маклая, 6, Москва, 117198, Россия
УДК 636.52/58.083:636.085.16 УДК 636.52/58.083:636.085.16
Сельское хозяйство, ветеринария, зоотехния, агрономия, агроинженерия, пищевые технологии
