Изучение чувствительности полевых штаммов Str. agalactiae и Str. uberis— возбудителей мастита коров к препарату на основе марбофлоксацина
Эффективная антибактериальная терапия мастита в условиях роста резистентных штаммов подразумевает обоснованный выбор препарата с учетом данных о чувствительности потенциального возбудителя.
Условно-патогенные и патогенные стафилококки и стрептококки являются лидерами среди возбудителей мастита КРС. В настоящее время, помимо Staph. aureus, Streptococcus agalactiаe и Streptococcus uberis являются наиболее частой причиной массовых субклинических и клинических маститов. Эти два возбудителя выработали защитно-приспособительные механизмы, которые обусловливают возможность быстрого распространения инфекции и ее рецидивов в условиях животноводческих хозяйств.
Так, для Str. agalactiаe ткани молочной железы являются основным резервуаром инфекции, а перезаражение животных происходит в основном при несоблюдении гигиены вымени.Str. agalactiаe, в отличие от Str. uberis, может долгое время сохраняться и размножаться в окружающей среде, поэтому предметы ухода, инвентарь, а также подстилка являются важными источниками распространения возбудителя.
Если рассматривать инфекцию Str. agalactiаe, то неверно выбранная антибактериальная терапия приведет к сохранению колоний возбудителя в молочной железе. Это будет провоцировать повышенную «соматику», даже несмотря на видимый успех лечения клинического мастита, и способствовать формированию устойчивых штаммов. Поскольку антибактериальные препараты применяются не только при лечении мастита, у персистирующего в тканях вымени возбудителя создаются условия для формирования устойчивости к различным группам антибиотиков (например, фторхинолонам, обычно используемым для лечения респираторных заболеваний).
В формировании резистентности полевых штаммов Str. uberis также будет играть роль массовая АБ-терапия — как взрослого поголовья, так и молодняка, особенно если в хозяйстве не соблюдается принцип ротации.
Цель исследования — изучение чувствительности полевых штаммов Str. Agalactiаe и Str. uberis к препарату на основе марбофлоксацина «Марбофлоцин 10%» (ООО «АлексАнн»), а также к ряду наиболее часто используемых АБП (амоксициллин и амоксициллин с клавулоновой кислотой, тилозин, тетрациклин, энрофлоксацин, норфлоксацин, гентамицин).
Материал и методы исследования
Для бактериологических исследований отбирали секрет молочной железы от коров с клинической формой мастита. Отбор проб производили в декабре 2021 года от животных, содержащихся на четырех молочных фермах Белгородской области. Всего было получено 15 проб. До отбора материала для исследования животные не подвергались лечению антибактериальными препаратами. Отбор проб секрета молочной железы из пораженных долей (четвертей) происходил после обработки вымени и сосков спиртовыми дезинфицирующими салфетками (в одноразовых перчатках) в одноразовые промаркированные стерильные контейнеры вместимостью 100 мл с завинчивающейся крышкой. От каждого животного отбирались средняя и последняя пробы (порции) молока общим количеством 40–60 мл.
Все пробы были промаркированы (номер животного, время и дата отбора пробы) и переданы в лабораторию в течение 6–8 часов с момента отбора. Транспортировка проб осуществлялась в закрытом контейнере при температуре 4 ± 2 оС.
Бактериологические исследования выполнены в испытательной лаборатории группы микробиологии ФГБОУ ВО «Белгородский ГАУ им. В.Я Горина». Пробы были подвергнуты бактериологическим исследованиям не позже чем через шесть часов с момента поступления в лабораторию. Сначала был произведен высев секрета на твердые питательные среды (кровяной агар, солевой агар, среда Эндо). Культивирование проводилось в обычной атмосфере при температуре 37 °С. Посевы на кровяном агаре и среде Эндо культивировали 17–18 часов, а на солевом агаре — 41–42 часа. Полученные колонии микроорганизмов были предварительно дифференцированы на основании их культуральных, тинкториальных и морфологических свойств.
Идентификация Str. agalactiae и Str. uberis. Микроорганизмы Str. agalactiae и Str. uberis были дифференцированы от других видов стрептококков согласно Методическим рекомендациям по микробиологическому исследованию молока и секрета вымени для диагностики мастита. Дифференциация производилась на основании следующих признаков: тип гемолиза, результаты КАМР-теста (СAMP-тест), рост на средах Карташовой, МПБ с 6,5% NaCl, МПБ с 40% желчи, МПБ pH 9,6, способность роста на среде с эскулином, способность ферментировать сорбит и манит, наличие редуктазы.
Определение минимальной ингибирующей концентрации марбофлоксацина к Str. agalactiae и Str. uberis. Определение МИК марбофлоксацина для выделенных полевых штаммов Str. agalactiae и Str. uberis проводилось методом серийных разведений в питательном ГМФ-бульоне макрометодом (пробирочный). Использовали суточные бульонные культуры выделенных штаммов с концентрацией микроорганизмов 106 КОЕ/мл. Культуры микроорганизмов вносили в пробирки с питательной средой, содержащей марбофлоксацин (опыт), и без антибиотика (контроль). Исследуемая концентрация марбофлоцина в питательной среде составляла 8 мкг/мл, 4 мкг/мл, 2 мкг/мл, 1 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 0,25 мкг/мл и 0,125 мкг/мл.
Пробирки закрывали стерильными ватно-марлевыми пробками и инкубировали в обычной атмосфере при температуре 35 °С в течение 20 часов. Для определения наличия роста микроорганизма пробирки с посевами просматривали в проходящем свете. Рост культуры в присутствии марбофлоксацина сравнивали с контрольными пробирками. МИК определяли по наименьшей концентрации марбофлоксацина, которая подавляет видимый рост микроорганизма.
Определение чувствительности Str. agalactiae и Str. uberis к амоксициллину, амоксициллину с клавуиновой кислотой, гентамицину, норфлоксацину, тилозину, тетрациклину и энрофлоксацину проводили диско-диффузным методом по стандартному протоколу, учет чувствительности к антибиотикам — по наиболее четкому контуру бактериальной культуры. Микроорганизмы классифицировали на чувствительные, умеренно чувствительные и устойчивые изоляты к АБП в соответствии с инструкцией к набору дисков с антибиотиком (диски производства ООО «Научно-исследовательский центр фармакотерапии», Россия).
Результаты и обсуждение
Из 15 проб секрета вымени коров с клиническими признаками мастита во всех случаях были выделены культуры стрептококков — возбудителей мастита. При этом в 11 пробах (73,3%) стрептококки были единственным обнаруженным патогеном, в 3 пробах (20%) также присутствовали стафилококки, в 1 (6,7%) — кишечная палочка. Возбудители мастита Str. agalactiae и Str. uberis были идентифицированы в восьми пробах (53,3%), в остальных пробах были выделены культуры Str. pyogenes, а также Str. feacalis. Культуры Str. agalactiae были выделены из секрета вымени коров всех четырех молочных ферм, культуры Str. uberis — из трех ферм.
Чувствительность семи выделенных культур Str. agalactiae и Str. uberis к марбофлоксацину была изучена методом серийных разведений. Результаты, полученные при определении МИК марбофлоксацина к выделенным культурам Str. agalactiae и Str. uberis, представлены в таблице 1.
Из данных таблицы следует, что МИК марбофлоксацина для большинства культур стрептококков — возбудителей мастита коров составляет 0,5 мкг/мл. У одной культуры (№ 1958 Str. agalactiae) МИК марбофлоксацина составила 0,25 мкг/мл.
Таким образом. средняя МИК марбофлоксацина для культур Str. uberis составляет 0,50 мкг/мл, а для Str. Agalactiae — 0,44 ± 0,13 мкг/мл.
Результаты, полученные при определении чувствительности выделенных возбудителей мастита Str. agalactiae и Str. uberis диско-диффузным методом к АБП амоксициллин и амоксициллин с клавулоновой кислотой, тилозин, тетрациклин, энрофлоксацин, норфлоксацин, гентамицин, представлены в таблице 2.
На основании исследований диско-диффузным методом к амоксициллину устойчивы все выделенные культуры Str. agalactiae и Str. uberis, к амоксициллину с клавулановой кислотой умеренно чувствительна одна культура Str. uberis (№ 6), остальные культуры стрептококков — возбудителей мастита устойчивы к данному сочетанию противомикробных препаратов.
Устойчивой к тилозину выявилась одна культура Str. agalactiae (проба № 4), остальные исследуемые культуры были чувствительны к данному антибиотику. Умеренно чувствительны к энрофлоксацину культуры Str. uberis (проба № 7) и Str. agalactiae (проба № 1). Все выделенные культуры Str. agalactiae и Str. uberis быличувствительны к гентамицину, норфлоксацину, тетрациклину (табл. 3).
Результаты исследования позволяют сделать вывод о том, что во всех четырех хозяйствах Белгородской области стрептококки играют важную роль в возникновении мастита. В исследованных пробах в 53,3% случаев выявляли культуры Str. agalactiae или Str. uberis, которые, как известно, могут быть причиной как клинического, так и субклинического мастита. Чувствительность полевых штаммов Str. agalactiae и Str. uberis несколько отличалась, однако преобладающее большинство выделенных культур уже обладает устойчивостью к амоксициллину, в том числе с клавулановой кислотой, а отдельные штаммы устойчивы к тилозину и умеренно чувствительны к энфрофлоксацину. Все выделенные культуры Str. agalactiae и Str. uberis чувствительны к гентамицину, норфлоксацину, тетрациклину, марбофлоксацину.
В данном исследовании для штаммов стрептококков, выделенных от коров с клиническими признаками мастита, была установлена следующая МИК марбофлоксацина: Str.uberis — 0,50 мкг/мл, Str. agalactiae — 0,44 ± 0,13 мкг/мл.
Таким образом, после введения терапевтической дозы препарата «Марбофлоцин 10%» концентрация марбофлоцина в плазме крови коров почти в три раза превышает МИК для возбудителей мастита Str. uberis и Str. agalactiae.
Учитывая, что концентрация марбофлоксацина в органах выше, чем концентрация в плазме крови, можно заключить, что марбофлоксацин в тканях вымени будет обеспечивать выраженный антимикробный эффект против возбудителей мастита Str. agalactiae и Str. uberis.
Выводы
Установлено, что полевые штаммы Str. agalactiae и Str. uberis, выделенные из секрета молочной железы коров с клиническими признаками мастита, были устойчивы к амоксициллину и чувствительны к марбофлоксацин, действующие вещество препарата «Марбофлоцин 10%». Среднее значение МИК марбофлоксацина для Str. beris составило в эксперименте 0,50 мкг/мл, а для Str. аgalactiae — 0,44 ± 0,13 мкг/мл.
Об авторах
Назар Валентинович Явников, кандидат ветеринарных наук, Пензенский государственный аграрный университет, ул. Ботаническая, д. 30, Пенза, 440014, Россия
virus0401@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-6900-331X
Игорь Меерович Кугелев, кандидат сельскохозяйственных наук, Смоленская государственная сельскохозяйственная академия ул. Большая Советская, дом 10/2, г. Cмоленск, 214000, Россия
igkugelev@mail.ru
Надежда Анатольевна Капай, кандидат биологических наук, ООО «АлексАнн»; ул. Виноградная 13, Долгопрудный, Московская область, 141705, Россия
nkapay@aleksann.ru
Анна Леонидовна Москвина, аспирант, Пензенский государственный аграрный университет, ул. Ботаническая, д. 30, Пенза, 440014, Россия
dolmen.buh@gmail.com
УДК 619:579.862:615.33:618.19-002:636.2 DOI: 10.32634/0869-8155-2023-373-8-36-40
Сельское хозяйство, ветеринария, зоотехния, агрономия, агроинженерия, пищевые технологии
