Оптимизация погружного культивирования мицелия Pleurotus ostreatusв динамике роста по показателям перекисного окисления липидов
Культивирование грибов — единственный во всем мире коммерческий эффективный крупномасштабный путь биоконверсии лигноцеллюлозных отходов в пищу. Интенсивная промышленная технология культивирования грибов предъявляет высокие требования к посевному мицелию, качество которого определяет урожайность плодовых тел. Это связано с тем, что мицелиальную биомассу базидиомицетов можно использовать как источник биологически активных соединений и пищевых добавок.
Промышленное производство препаратов для пищевой промышленности, созданных на основе глубинного мицелия грибов, представлено в работе. Тем не менее одной из важных причин отсутствия широкомасштабного производства мицелия базидиомицетов является их низкая скорость роста, поэтому весьма важный вопрос — подбор среды выращивания при погруженном культивировании базидиомицетов на жидких питательных средах для обеспечения максимального выхода биомассы, особенно, с анализом процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ).
Оценка липидной пероксидации основана главным образом на непрямых методах, с помощью которых анализируют вторичные или конечные продукты, образованные при превращении гидроперекисей, их метаболизме и разрушении. Данные продукты могут оказывать различное влияние на структуру и функциональное состояние биологических молекул. Для этого широко используют определение концентрации гидроокисей реакцией с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) спектрофотометрическим методом. Реакция основана на реакционной способности ТБК с малоновым диальдегидом (МДА) и образованием комплекса активных продуктов, которые являются показателем окислительно-восстановительного состояния клеточного метаболизма.
Как объект промышленного производства вешенка обыкновенная (Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm.) характеризуется биологической скороспелостью, холодостойкостью в период плодоношения, относительно коротким циклом выращивания, устойчивостью к болезням и вредителям, поэтому в работе в качестве объекта исследования использовали базидиомицеты Pleurotus ostreatus.
Цель работы — выявление закономерности изменения показателей скорости роста Pleurotus ostreatus и процессов ПОЛ при использовании карбоната магния в составе среды культивирования базидиомицетов.
Материал и методы исследования
Были использованы базидиомицеты Pleurotus ostreatus штамм НК-35 из коллекции агрохимической лаборатории Учебного научно-производственного комплекса «Агроцентр» Вавиловского университета.
Выращивание мицелия проводили методом погружного культивирования. В колбах 750 мл и 1000 мл с применением ротационной качалки при 200 об/мин. Выбранная температура культивирования — 25–27 ºС. Карбонат магния в концентрации 1х10–6 (красный©), 1х10-4 (желтый©), 1х10-2 (синий©), контроль (зеленый©) (без добавки карбоната магния) вносили в 2%-ную жидкую среду из пшеничной муки 1-го сорта. Приготовленные среды автоклавировали при 1,2 атм. в течение 30 минут.
Опыты по измерению биомассы проводили в пяти повторностях. Для количественной обработки данных использовали программу Microsoft Excel 2003. При статистической обработке результатов пользовались методом расчета стандартного отклонения среднего арифметического при уровне доверительной вероятности 0,95. Полный процесс культивирования по длительности составил 14 суток. Метод определения ростовых характеристик. Скорость роста при глубинном культивировании определяли в соответствии с рекомендациями Дудка и др. (1982) по накоплению сухой биомассы в единицу времени в зависимости от продолжительности выращивания.Метод определения концентрации белка в растворе. Концентрацию белка определяли по методу Бредфорда с использованием красителя Кумасси бриллиантового синего. Он основан на эффекте связывания с белками одной из разновидностей данного кислого красителя — R-250 и G-250. Количество белка в исследуемом образце определяют по значению оптической плотности, используя калибровочный график, построенный по результатам измерений для растворов белка с известной концентрацией. Метод определения пероксидного окисления липидов. На 14-е сутки определяли интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ). Состояние ПОЛ оценивали по содержанию ТБК-активных продуктов (2-тиобарбитуровая кислота, ТБК), суммарное содержание которых выражали в пересчете на малоновый диальдегид (МДА) в соответствии с модифицированной методикой.
Полученные данные были обработаны методом многомерной регрессии (метод главных компонент) МГК, где особое внимание уделяется графикам счетов. На графике счетов каждый образец изображается в координатах (t1, t2), обозначаемых ГК1 и ГК2. Близость двух точек обозначает их схожесть, то есть положительную корреляцию. Метод главных компонент часто применяется при исследовательском анализе химических данных. МГК можно трактовать как проецирование данных на подпространство меньшей размерности (А). Обобщением МГК является метод проекций на латентные структуры (ПЛС) (Projection on Latent Structures, PLS), который сейчас является самым популярным методом многомерной калибровки.
Результаты и обсуждение
Усиленное ПОЛ и накопление МДА могут привести к нарушению целостности мембраны и повреждению клетки. В условиях окислительного стресса время жизни образовавшихся АФК и их токсическое действие контролируются системой антиоксидантной защиты клетки, то есть соответствующими ферментами и метаболитами. При проведении исследований была выявлена зависимость образования биомассы от концентрации карбоната магния в питательной среде.
Хорошо известна концепция координированного действия активных форм кислорода (АФК) и метаболитов, важных для регуляции роста, развития и стресс-толерантности растительных организмов. АФК — многофункциональные сигнальные молекулы, вносящие вклад в приспособительную способность, а воздействие какого-либо соединения — выраженного антиоксиданта — приводит к слабому развитию окислительного стресса.
Результаты определения биомассы мицелия базидиомицетов, культивируемых погруженным способом в присутствии карбоната магния в концентрации (1х10-2, 1х10-4, 1х10-6) на 7-е, 10-е, 14-е сутки после засева питательных сред, представлены в таблице 1.
По данным числовым значениям (табл. 1) четко прослеживается положительная динамика влияния карбоната магния на ростовые характеристики грибов при погруженном культивировании в зависимости от концентрации раствора. Величины уровня концентрации добавки в среде культивирования были сопоставимы с используемыми величинами из литературных данных.
Низкий показатель биомассы мицелия базидиомицетов при концентрации карбоната магния 1х10-2 зависит от возможного противодействия АФК, так как агенты с антиоксидантными свойствами оказывают влияние на биохимические процессы базидиомицетов и могут служить одной из причин снижения ростовых показателей.
Однако при снижении концентрации до 1х10-6 показатель биомассы мицелия увеличивается до 120,5% биомассы к контролю. Далее полученные показатели были внесены в матричные данные при обработке результатов эксперимента методом многомерной регрессии.
Определение количества продуктов перекисного окисления липидов является важной морфологической характеристикой, позволяет оценить уровень метаболизма и выявить влияние коньюгатов на активность сигнальных систем в растительных клетках.
Накопление биомассы контролировали по степени увеличения оптической плотности, которую измеряли с помощью ФЭК. Концентрацию биомассы определяли с использованием соответствующего калибровочного графика.
Обработка полученных данных МГК-анализом показала, что динамика роста и показатель МДА связаны межу собой (рис. 1).
Из графика младших компонент видно, что переменные, отмеченные желтым и красным цветом, образуют компактные группы в левой части графика. Точки достаточно близко расположены друг к другу, что означает их тесную положительную корреляцию (рис. 1а). Экспериментальными данными зафиксировано, что снижение концентрации МДА наступает при снижении концентрации карбоната магния (1х10-6) и положительно сказывается на динамике роста мицелия. Переменные группы, отмеченные синим цветом, находятся в разрозненном положении. Это свидетельствует о высокой концентрации МДА. Таким образом, вышеуказанные данные позволяют констатировать четкую зависимость концентрации МДА от концентрации карбоната магния.
В полученной биомассе, культивируемой с добавлением карбоната магния, наблюдалась активация перекисного окисления липидов. Об интенсивности протекания ПОЛ большинство авторов судят по накоплению в тканях конечного продукта липопероксидации — МДА. Так, самое высокое содержание МДА было зафиксировано при концентрации 1х10-2 (рис. 1) по сравнению с более низкими концентрациями и контролем.
На графике старших счетов (рис. 2) наблюдаем еще более четкую зависимость увеличения биомассы от уменьшения концентрации МДА.
Анализ графика объяснений дисперсии остатков позволяет определить, сколько главных компонент достаточно для моделирования полученных данных. Для определения числа главных компонент (ГК) было исследовано качество описания при увеличении числа ГК. Из рисунка 2 видно, что двух ГК достаточно для моделирования полученных данных — они объясняют 98% вариации описания дисперсий. Предположительно, по полученным данным, для описания процесса прогнозирования роста мицелия базидиомицетов достаточно определения значений ПОЛ и концентрации белка при использовании метода многомерной регрессии с применением метода главных компонент.
Усиленное ПОЛ и накопление МДА могут привести к нарушению целостности мембраны и повреждению клетки. В условиях окислительного стресса время жизни образовавшихся активных форм кислорода (АФК) и их токсическое действие контролируются системой антиоксидантной защиты клетки, то есть соответствующими ферментами и метаболитами. При проведении исследований была выявлена зависимость образования биомассы от концентрации карбоната магния в питательной среде. Данные изменения влияют на рост биомассы мицелия при погруженном культивировании Pleurotus ostreatus и зависят от состава питательной среды.
Выводы
Установлено, что активность процессов ПОЛ при применении карбоната магния имеет обратно пропорциональную зависимость от концентрации добавки, при концентрации 1х10-6 рост биомассы мицелия гриба Pleurotus ostreatus возрастает на 20,5% по сравнению с контролем.
Обработанные МГК данные об интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) и концентрации белка в растворе и накопления биомассы мицелия учитывают априорную информацию о процессах при разноразмерных показателях и позволяют решить задачу определения величины химического ранга системы — числа главных компонент для определения границ оптимальных концентраций карбоната магния при планировании следующих экспериментов.
На основании исследований можно рекомендовать использование питательной среды с концентрацией карбоната магния (1х10-6) при погруженном культивировании P. ostreatus для увеличения выхода мицеллярной биомассы.
Об авторах
Лариса Геннадиевна Ловцова, кандидат технических наук, доцент кафедры микробиологии и биотехнологии, Саратовский государственный университет генетики, биотехнологии и инженерии им. Н.И. Вавилова, г. Саратов, пр-т им. Петра Столыпина, д. 1, здание 4, стр. 3, 410012, Россия
lauisalovtsova2018@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-3114-3840
+7 (904) 243-63-73
Маргарита Васильевна Забелина, доктор биологических наук, профессор кафедры технологии производства и переработки продукции животноводства, Саратовский государственный университет генетики, биотехнологии и инженерии им. Н.И. Вавилова, г. Саратов, пр-т им. Петра Столыпина, д. 1, здание 4, стр. 3, 410012, Россия
mvzabelina@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-2284-029X
Александр Владимирович Майоров, младший научный сотрудник, Саратовский государственный университет генетики, биотехнологии и инженерии им. Н.И. Вавилова, г. Саратов, пр-т им. Петра Столыпина, д. 1, здание 4, стр. 3, 410012, Россия
mayorovsar@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-1237-2907
Иван Валентинович Ловцов, аспирант кафедрытехнологии производства и переработки продукции животноводства, Саратовский государственный университет генетики, биотехнологии и инженерии им. Н.И. Вавилова, г. Саратов, пр-т им. Петра Столыпина, д. 1, здание 4, стр. 3, 410012, Россия
bk-192@bk.ru
Тимур Борисович Тяпаев, кандидат экономических наук, доцент кафедрытехнологии производства и переработки продукции животноводства, Саратовский государственный университет генетики, биотехнологии и инженерии им. Н.И. Вавилова, г. Саратов, пр-т им. Петра Столыпина, д. 1, здание 4, стр. 3, 410012, Россия
https://orcid.org/0000-0001-6724-3603
Владимир Святославович Мавзовин, кандидат математических наук, доцент кафедры математики, Московский государственный строительный университет, г. Москва, Ярославское шоссе, д. 26, 129337, Россия
mavzovin@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-8085-3315
УДК 579.222+577.1 DOI: 10.32634/0869-8155-2023-371-6-126-130
Сельское хозяйство, ветеринария, зоотехния, агрономия, агроинженерия, пищевые технологии
