Полиморфные варианты генов CD62L и ACSL1 в связи с устойчивостью коров к маститу
Мастит имеет полигенную природу, и в его этиологии выделяют три фактора, таких как инфекционная составляющая, окружающая среда и макроорганизм. Несмотря на значительное количество исследований, остается неясным, почему при одинаковых условиях содержания в стаде одни животные остаются неинфицированными, а у заболевших течение болезни резко различается (клиническая и субклиническая форма мастита). В этом случае стоит обратить внимание на индивидуальные особенности организма, а именно на его генетический фон. В связи с этим в последние годы особую актуальность приобретают исследования, направленные на выявление генетических маркеров устойчивости коров к маститу. Среди генов-кандидатов выделяют две значимые группы — гены иммунного ответа и гены, ассоциированные с качественным составом молока. Изучение возможных генов-кандидатов в целевых областях и генах может быть использовано для повышения точности определения QTL и геномного прогнозирования устойчивости коров к заболеванию маститом.
L-селектин, кодируемый геном CD62L, представляет собой трансмембранный гликопротеин I типа, основной ролью которого является регулирование трансмиграции лейкоцитов, включая нейтрофилы, к очагу воспаления. Повышенная экспрессия гена CD62L наблюдается именно на ранних стадиях инфицирования, что в значительной мере определяет прогноз течения болезни.
Ген ACSL1 занимает одно из ключевых мест в регуляции синтеза ацил-КоА-синтетазы, фермента, регулирующего синтез жирных кислот в адипоцитах млекопитающих и опосредованно регулирующего гомеостаз глюкозы. R. Joseph и др. (2015) показали, что нокдаун гена ACSL1 приводит к истощению ACSL1, при этом изменяется экспрессия воспалительных генов (хемокинов) в дифференцированных адипоцитах, что в свою очередь приводит к снижению накопления липидов, а также снижению поглощения глюкозы адипоцитами. Исследования Y. Liang и др. (2020) показали значимые ассоциации шести SNP гена ACSL1 на показатели молочного жира, белка и количество соматических клеток молока коров голштинской породы.
Цель работы — анализ связи полиморфных вариантов гена ACSL1 (rs208522533) и CD62L (rs41803917 и rs109966956) с показателями молочной продуктивности и уровнем соматических клеток в молоке коров айрширской породы.
Материал и методы исследования
Выборку (n = 191) составили животные айрширской породы, принадлежащие одному из племенных хозяйств Ленинградской области в 2022 году. Образцы ДНК были выделены из лейкоцитов венозной крови животных общепринятым методом фенол-хлороформной экстракции. Были отобраны два потенциально функциональных SNP в гене CD62L (rs41803917 — экзон 4 и rs109966956 — экзон 3) и один SNP в гене ACSL1 (rs208522533 — интрон 2). Праймеры для генотипирования были подобраны в программе BLAST Ensembl. При проведении ПЦР использовали праймеры следующей последовательности: для rs208522533 гена ACSL1 F:ACCTGATGGGACCTGTGTG и R:TTCCCAGGGCAGTGATGG; для rs41803917 гена CD62L — F:TATCCATTCCTTAACAGCCGGA и R:TTCTTGTAAACCCTGGTCATGC; для rs109966956 гена CD62L — F:TGCAGCTACACAATTCACACTG и R:CAGGTTCCCATGGGGTTAG. ПЦР для каждого SNP проводили в термоциклере C1000 (Bio-Rad Laboratories, Inc., США) по следующему протоколу: начальная денатурация при 95 ºC в течение 5 мин; 35 циклов — 95 ºC, 45 с; отжиг праймеров — при 60 ºС, 40 с; элонгация — при 72 ºC, 40 с; финальная элонгация — при 72 ºC, 5 мин. ПЦР-продукт обрабатывали эндонуклеазой рестрикции согласно протоколу фирмы-производителя (SibEnzyme Ltd., Russia). Для rs208522533 гена ACSLI аллель А определяли при отсутствии сайта рестрикции для Hae III, аллелю G соответствовали фрагменты 169 п. н. и 133 п. н. Для rs41803917 гена CD62L аллель С определялся наличием фрагментов рестрикции размером 307 п. н. и 93 п. н., аллелю Т соответствовал фрагмент размером 400 п. н. (отсутствие сайта рестрикции для Apa I). Генотипы по rs109966956 гена CD62L определяли с использованием рестриктазы Pct I. Наличие фрагментов длиной 400 п. н. и 99 п. н. соответствовало аллелю А, при отсутствии сайта рестрикции определялся фрагмент длиной 499 п. н., который соответствовал аллелю G.
Данные по удою (кг), молочному жиру (МДЖ, %), молочному белку (МДБ, %), и количеству соматических клеток (КСК, 103 ед/мл) в молоке коров за первую законченную лактацию были получены из записей зоотехнического учета хозяйства в электронной базе «Селэкс». Племенная ценность (ПЦ) по изучаемым хозяйственно-полезным признакам коров рассчитана в компьютерной программе «СГС-ВНИИГРЖ». Среднее КСК за первую лактацию переводили в балльную оценку (БОКСК, балл) на основе двоичного логарифма. Биометрическая обработка данных выполнена с помощью программы Statistica 10 (Data Analysis Software System) Version 13 Dell Inc (2016, software.dell.com). ANOVA выполняли при уровне значимости р ˂ 0,05. Для определения различий средних значений переменных между анализируемыми группами применяли критерий Тьюки или Краскела — Уоллиса.
Результаты и обсуждение
Анализ частоты генотипов и аллелей изучаемых генов показал, что по rs41803917 гена CD62L определена высокая встречаемость аллеля G (0,804) и более 60% животных имели генотип GG (0,639). Частота генотипа AG составила 0,330, а генотип АА определен как редкий (0,031). По rs109966956 гена CD62L у 64,9% особей выявлен генотип СС (0,649), а частота аллеля С составила 0,801. Встречаемость гетерозиготного генотипа ТС определена на уровне 0,309. Генотип ТТ установлен только у восьми животных, его частота составила 0,042. Результаты генотипирования по rs208522533 гена ACSLI показали, что 99% животных были носителями генотипа GG (0,994) и только у одной особи выявлен гетерозиготный генотип AG (0,006). Частота аллелей была следующей: аллель G — 0,997, аллель А — 0,003).
Сравнительный анализ групп коров с разными генотипами по rs41803917 гена CD62L (табл. 1) показал, что молоко особей с генотипом AG отличалось высокими средними значениями абсолютного показателя процентного содержания белка и ПЦ этого признака в сравнении с особями с генотипом GG (р ≤ 0,05). Для животных с редким генотипом АА определены высокие значения БОКСК и ПЦ по БОКСК и тенденция к снижению показателя МДБ (при р = 0,07) относительно животных с гетерозиготным генотипом (р ≤ 0,05).
Сравнительный анализ как абсолютных значений качественных показателей, КСК и БОКСК молока коров, так и ПЦ по изучаемым признакам коров с разными генотипами по rs109966956 гена CD62Lпоказал, что животные с генотипом TT имели высокие значения БОКСК и ПЦ по БОКСКв сравнении со сверстницами с генотипами СС и ТС (р ≤ 0,001).
По мнению Rainard и др. (2018), резистентность к маститу можно рассматривать как фенотипический признак вымени, определяющийся физиологическим статусом и особенностями генетики животного. Ряд генов иммунного ответа, в том числе и CD62L, ассоциированы с признаками молочной продуктивности и устойчивостью коров к маститу, а именно с содержанием соматических клеток в молоке, как основного индикатора качества молока — сырья. По данным Ateya и др. (2022), экспрессия гена CD62L в крови была значительно выше в группе коров, больных маститом.
Результаты исследований показали, что значения ПЦ по БОКСК были выше в малочисленных группах животных с генотипом АА по rs41803917 (р ≤ 0,05) и генотипом ТТ по rs109966956 (р ≤ 0,001), при этом по показателям абсолютных значений КСК не было установлено различий между анализируемыми группами животных. По данным Болгова и др. (2018), перевод абсолютных значений КСК в балльную оценку повышает точность самой оценки коров на предмет маститоустойчивости. Для оценки состояния и прогнозирования резистентности к маститу коров автор предлагает градацию, согласно которой уровень БОКСК до 3,9 балла показывает, что коровы здоровы и отличаются высокой маститоустойчивостью, 4–4,9 балла — нормальная резистентность к маститу, 5–5,9 — резистентность ниже среднего уровня, 6 и более баллов — низкая резистентность в маститу.
В исследовании у 70,3% животных средняя оценка БОКСК составила 1,72 балла, у 18,7% — 3,44 балла. В целом это свидетельствует о том, что превалирующая доля изучаемой выборки коров была свободна от мастита на протяжении первой лактации. В зависимости от генотипа относительная численность коров с БОКСК свыше 3,9 балла колеблется от 1,6% и 1,7% среди животных с гетерозиготными генотипами AG и TC соответственно, до 16,7% и 37,5% — AA и TT соответственно.
Мастит, независимо от формы течения болезни, влечет за собой изменения компонентного состава молока, при этом для коров айрширской породы они менее выражены в сравнении с голштинскими коровами. В исследовании было показано, что особи с генотипом AG по rs41803917 гена CD62L имели высокие показатели процентного содержания белка (р ≤ 0,05), и низкие значения по уровню БОКСК (р ≤ 0,05). В работе Dusza и др. (2018) два SNP-гена CD62L были ассоциированы с признаками молочной продуктивности у голштино-фризских, однако не было получено данных по связи изучаемых SNP с устойчивостью коров к клиническому маститу. Как предположили авторы, это может быть объяснено в какой-то степени взаимным влиянием генов. Ген CD62L расположен на BTA 16, которая включает QTL признаков молока.
Выводы
У коров айрширской породы выявлен низкий уровень полиморфизма гена ACSLI по rs208522533, при этом 99,4% особей имели генотип GG. Генотип AG по rs41803917 гена CD62L был ассоциирован с высокими средними показателями процентного содержания белка в молоке коров и низким БОКСК (р ≤ 0,05), а коровы с генотипами АА по rs41803917 и ТТ по rs109966956 имели высокие значения ПЦ по БОКСК в сравнении со сверстницами других генотипов (р ≤ 0,05, р ≤ 0,001), что предполагает возможность использования SNPs гена CD62L (rs41803917 и rs41803917) в качестве потенциальных маркеров устойчивости к маститу у коров айрширской породы.
Об авторах
Марина Владимировна Позовникова, кандидат биологических наук,Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных — филиал Федерального исследовательского центра животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста,Московское шоссе, д. 55А, Санкт-Петербург, Пушкин, 196601, Россия
pozovnikova@gmail.com; https://orcid.org/0000-0002-8658-2026
Елена Анатольевна Романова, младший научный сотрудник,Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных — филиал Федерального исследовательского центра животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста,Московское шоссе, д. 55А, Санкт-Петербург, Пушкин, 196601, Россия.
splicing86@gmail.com; https://orcid.org/0000-0002-4225-5533
Ольга Васильевна Тулинова, кандидат сельскохозяйственных наук,Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных — филиал Федерального исследовательского центра животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, Московское шоссе, д. 55А, Санкт-Петербург, Пушкин, 196601, Россия
tulinova_59@mail.ru
УДК 636.2.034/ 575.162 DOI: 10.32634/0869-8155-2023-369-4-57-61
Сельское хозяйство, ветеринария, зоотехния, агрономия, агроинженерия, пищевые технологии
