Влияние внутриклеточного пероксида водорода на качественные показатели спермы петухов в цикле замораживания (оттаивания)
Для сохранения генетических ресурсов сельскохозяйственных птиц in vitro разработаны методики хранения спермы петухов и примордиальных зародышевых клеток в условиях сверхнизких температур. На данный момент самым распространенным методом является криоконсервация спермы.
Исследования в области замораживания сперматозоидов птиц в условиях сверхнизких температур начались более 70 лет назад, и за это время были разработаны и опробованы протоколы криоконсервации, отличающиеся скоростью фазового перехода семени от жидкого состояния к твердому, использованы криопротекторы проникающего и непроникающего типа действия, опробованы разбавители, отличающиеся компонентным составом.
На данный момент криоконсервация спермы петухов — единственный неинвазивный и наименее дорогой в реализации метод in vitro, доступный на сегодняшний день, позволяющий сохранять редкие генотипы птиц.
Несмотря на многолетние исследования по разработке и модернизации протоколов криоконсервации спермы петухов, до сих пор не существует стандартизированной методики, обеспечивающей стабильные и высокие показатели фертильности.
Основной проблемой криоконсервации спермы птиц по-прежнему остается низкая общая подвижность замороженных (оттаянных) сперматозоидов в сравнении с другими сельскохозяйственных животными.
Одной из причин снижения общей подвижности после криоконсервации спермы петухов может быть влияние повышенной концентрации образующихся активных форм кислорода. Известно, что супероксидный анион — радикал О2∙- — и пероксид водорода H2O2 являются наиболее распространенными активными формами кислорода (АФК). В малых концентрациях они способствуют капацитации сперматозоидов, гиперактивации и целостности акросом, в то время как высокие концентрации АФК увеличивают степень фрагментации ДНК и снижают общую подвижность сперматозоидов, что было показано в исследованиях, проведенных на семени человека, лошади и свиньи.
Морфологические и биохимические особенности строения сперматозоидов птиц, делающие их более восприимчивыми к процессу криоконсервации по сравнению со сперматозоидами млекопитающих, могут также являться причиной, по которой сперма птиц больше подвержена влиянию оксидативного стресса.
Согласно ряду исследований, липидный состав плазматической мембраны сперматозоидов имеет существенные отличия от состава мембран соматических клеток и содержит высокие концентрации эфирных липидов и стеролов. В отличие от сперматозоидов млекопитающих, в сперматозоидах птиц мало цитоплазматических антиоксидантов, а мембраны богаты полиненасыщенными жирными кислотами.
Данная особенность строения плазматической мембраны спермиев делает сперму птиц восприимчивой к свободнорадикальному окислению липидов, результатом процесса перекисного окисления липидов являются снижение текучести мембран, облегчение перехода молекул фосфолипидов из одного монослоя мембран в другой, увеличение проницаемости мембран для различных субстанций (K+, Ca2+ и т. д.), ковалентная модификация и изменение функциональной активности мембранных протеинов, рецепторов, энзимов и ионных каналов. Некоторые из продуктов перекисного окисления полиненасыщенных жирных кислот оказывают выраженное цитотоксическое действие.
Антиоксидантная способность сперматозоидов низка, но ферментативные и неферментативные антиоксиданты семенной плазмы защищают сперму от окислительного стресса, нивелируя влияние свободных радикалов. Однако, когда концентрация АФК превышает возможности антиоксидантных систем клеток, свободные радикалы повреждают макромолекулы, такие как ДНК, белки и липиды, могут влиять на образование митохондриальной АТФ, что в конечном итоге приводит к снижению фертильности спермы.
Сигналом для запуска данного типа реакции может служить некоторое изменение внутриклеточной среды, приводящее к смещению равновесия концентраций прооксидантных и антиоксидантных компонентов с последующей активацией процессов окисления. Одним из таких факторов является процесс криоконсервации. Цикл замораживания (оттаивания) напрямую влияет на выработку АФК.
Цели исследования — проследить изменение уровня внутриклеточных АФК, в частности пероксида водорода (H2O2), в процессе криоконсервации спермы петухов, оценить его влияние на качественные показатели спермы петухов и жизнеспособность сперматозоидов.
Материалы и методы исследования
Исследование проводилось на базе ЦКП «Генетическая коллекция редких и исчезающих пород кур», ВНИИГРЖ в 2022 году. Объектом исследования служили петухи (Gallus gallus domesticus), (♂n = 10) мясо-яичной породы царскосельская (селекция ВНИИГРЖ) в возрасте 61–63 недель.
Экспериментальное поголовье содержалось в одинаковых условиях, все особи находились в индивидуальных клетках. Кормление, поение и световой режим — в соответствии с возрастными нормами, принятыми в ЦКП «Генетическая коллекция редких и исчезающих пород кур», ВНИИГРЖ. Сперму собирали методом абдоминального массажа (Burrows and Quinn) в пенициллиновые флаконы объемом 10 мл дважды в неделю в течение двух недель. К свежеполученным эякулятам добавляли разбавитель ЛКС-1 в соотношении 1:1 с целью дальнейшей криоконсервации.
Оценку качественных показателей спермы проводили для нативных эякулятов и криоконсервированного семени в лабораторных условиях с помощью программного обеспечения CASA (Computer-Assisted Semen Analysis; программное обеспечение Аргус-CASA, ООО «АргусСофт», Россия; микроскоп Motic® BA310E, Motic Instruments Inc., Канада).
Индивидуальные эякуляты разбавляли двухкомпонентным разбавителем ВНИИГРЖ до соотношения 1:100 и помещали 10 мкл семени в камеру Маклера. Каждый эякулят был оценен по таким показателям, как общая подвижность, объем эякулята и концентрация сперматозоидов в двух повторностях. Концентрация сперматозоидов определялась с помощью спектрофотометра Accuread Photometer (IMV Technologies, UK).
Эквилибрация разбавленного семени происходила в условиях t = 5 °С в течение 40 мин. В качестве криопротектора использовали N, N-диметилацетамид (DMA) производства Sigma (Aldrich, США). Добавление DMA осуществлялось после эквилибрации эякулятов в количестве, соответствующем конечной концентрации — 6%. После внесения DMA образцы снова помещали в холодильную камеру на 1 мин. для уравновешивания температуры.
Криоконсервация производилась в гранулах по методике, разработанной Л.Е. Нарубиной, А.Д. Курбатовым и др.
Семя набирали в капиллярную пипетку и накапывали в жидкий азот с расстояния 7,5 см от поверхности (-41,4 °С). Контроль положения пипетки осуществлялся с помощью термопары (Temperature measuring instrument THERM 2420, Ahlborn, Германия). Скорость раскапывания составляла ~1,4 гранулы в секунду. Размораживание гранул производили на нагретой металлической пластине (t = 60 °С).
Анализ образцов спермы петухов проводили с использованием проточного цитометра Cytoflex (Beckman Coulter Inc., США). Для каждого образца исследовали не менее 2000 событий при скорости потока 50 клеток/сек. Популяцию сперматозоидов отбирали с помощью бокового светорассеяния (SSC-A) и малоуглового светорассеяния (FSC-A) для исключения посторонних клеток и конгломератов сперматозоидов.
Зеленую флуоресценцию регистрировали с помощью полосового фильтра FITC длиной волны 525/40 нм, красную флуоресценцию — с помощью полосового фильтра PE длиной волны 585/42 нм.
Для анализа данных, полученных на проточном цитофлуориметре, использовали программное обеспечение CytExpert, Version 2.4.0.28 (Beckman Coulter Inc., США).
Соотношение клеток, содержащих повышенный уровень внутриклеточного пероксида водорода (H2O2), анализировали методом проточной цитометрии. Для детектирования данного соединения использовали флуорохром — 2,7-дихлорфлуоресцеина диацетат (DCFH-DA) производства Sigma (Aldrich, США). Этот краситель при связывании с H2O2 и возбуждении соединения длиной волны 492–495 нм испускает флуоресценцию зеленого цвета.
Образцы семени были разбавлены до концентрации 30 х 106 сперматозоидов на 1 мл. Суспензию клеток дважды промывали двухкомпонентным разбавителем для спермы петухов ВНИИГРЖ (патент № 2482816, 2013 г.) при 1200 об/мин в течение 7 мин. После к образцам спермы добавляли 20 мкл DCFH-DA (конечная концентрация — 5 мкМ/мл) и помещали в термостат на 30 мин. (t = 39,5 °С). Спустя 30 мин. производилась двойная отмывка образцов от остатков флуорохрома (1200 об/мин в течение 7 мин.) (рис. 2).
При оценке уровня флуоресценции на проточном цитофлуориметре выделяли две популяции клеток — с высоким содержанием H2O2 и с низким содержанием H2O2 (рис. 2). Часть суспензии клеток, предназначенной для исследования на проточном цитофлуориметре, использовали для приготовления цитологических препаратов. Цель данной манипуляции — визуализация корректности работы флуорохрома на сперматозоидах петухов.
Использовался микроскоп с флуоресценцией Axio Imager А1, увеличение — х1000 (Carl Zeiss Microscopy, Germany).
Вышеописанный протокол детекции внутриклеточного H2O2 использовался как для образцов свежеполученных эякулятов, так и для образцов замороженного (оттаянного) семени.
Популяции живых и мертвых клеток определяли методом проточной цитометрии с использованием флуорохрома — пропидия йодид (PI) — производства Sigma (Aldrich, США). PI не проникает в живые и апоптотические клетки, но окрашивает мертвые клетки, связываясь с нуклеиновыми кислотами. Максимум возбуждения данного флуорохрома наблюдается при длине волны 535 нм.
Образцы спермы были разбавлены до концентрации 30 х 106 сперматозоидов на 1 мл. Суспензию клеток дважды промывали двухкомпонентным разбавителем для спермы петухов ВНИИГРЖ при 1200 об/мин в течение 7 мин. После к образцам спермы добавляли 2 мкл PI (конечная концентрация — 5 мкг/мл) (рис. 1).
Вышеописанный протокол окраски красителем PI использовался как для образцов свежеполученных эякулятов, так и для образцов замороженного (оттаянного) семени.
Статистический анализ данных включал в себя расчет средних значений, стандартной ошибки средней и коэффициента изменчивости. Оценку значимости различий между массивами данных проводили при помощи t-критерия Стьюдента.
Для определения взаимосвязи между массивами данных рассчитывался ранговый коэффициент Спирмена. Различия считались достоверными при уровне 95% (p < 0,05). Анализ осуществляли с помощью программного обеспечения Microsoft Excel 2013 (США).
Результаты и обсуждение
Общая подвижность сперматозоидов в свежеполученных эякулятах петухов (♂n = 10) находилась в пределах от 85 до 90%. Объем эякулята в среднем составил 0,65 ± 0,05 мл, средняя концентрация сперматозоидов — 3,566 ± 0,305 млрд/мл (табл. 1).
Подвижность замороженного (оттаянного) семени находилась в пределах от 22,50 до 52,50%. Качественные показатели нативных эякулятов имели минимальные отличия и находились на высоком уровне, отвечая требованиям нормативных документов.
Анализ показателей жизнеспособности сперматозоидов в индивидуальных эякулятах, оцененной с использованием флуорохрома PI, показал незначительные различия между особями в нативной сперме — от 15,24 до 20,84% мертвых клеток, в замороженном (оттаянном) семени различия были более выраженными и находились в пределах от 26,85 до 39,87% мертвых клеток от общей популяции. Среднее увеличение доли мертвых клеток в образцах семени после криоконсервации — 13,49%.
Точечные графики, построенные из данных, полученных на проточном цитуфлуориметре Cytoflex (Beckman Coulter, Inc.), отображают данные различия на примере индивидуальных эякулятов (табл. 2, рис. 1).
Стоит отметить, что полученные данные согласуются с опытами зарубежных исследователей, которые использовали двойную окраску SYBR-14/PI и готовые коммерческие киты для определения апоптоза (Annexin V-FITC Apoptosis Detecetion Kit (APOAF-50TST, Sigma, St. Louis, MO, USA), что говорит о возможности более простой оценки жизнеспособности сперматозоидов петухов посредством использования одного флуорохрома — PI.
Анализ содержания внутриклеточного пероксида водорода в индивидуальных эякулятах показал, что в нативной сперме средний процент клеток с высоким содержанием H2O2 составлял от 38,77до 71,71%, в замороженной (оттаянной) сперме диапазон значений был меньше и составил от 62,13 до 81,09% (табл. 2, рис. 2).
Популяция клеток с высоким содержанием внутриклеточного пероксида водорода в нативных эякулятах в среднем составила 55,25%, в замороженном (оттаянном) семени доля клеток увеличилась и составила уже 71,34%.
Стоит отметить, что достоверной прямолинейной взаимосвязи между содержанием внутриклеточного H2O2 и жизнеспособностью сперматозоидов, как в нативной сперме, так и в замороженном (оттаянном) семени, не было выявлено (рис. 2).
Коэффициент корреляции между уровнем внутриклеточного H2O2 внативной сперме и общей подвижностью замороженного (оттаянного) семени составил -0.65 (р < 0,05).
Установлено, что в случае нарушения перекисного гомеостаза именно митохондриальная ДНК (мтДНК) подвергается окислительному воздействию АФК в большей степени, чем ядерная, ввиду топологической близости к источникам генерации АФК и не обладает защитой, которую обеспечивают белки гистоны.
В ходе взаимодействия H2O2, продуцируемой в дыхательной цепи с ионами Fe2+ и Сu2+ (локализованными в митохондриальных мембранах), образуется гидроксид-радикал, ответственный за повреждения мтДНК. Несмотря на то что в данном исследовании не оценивался функциональный статус митохондрий, при исследовании цитологических препаратов замороженных (оттаянных) сперматозоидов петухов, окрашенных DCFH-DA, наблюдалась флуоресценция, которая исходила из средней части сперматозоида — области, где расположены митохондрии, которые являются основным источником АФК в сперматозоидах (рис. 3). Согласно литературным данным, криоконсервация способна привести к нарушению или даже полному прерыванию митохондриальной дыхательной цепи. Это прерывание провоцирует восстановление кислорода с образованием вместо молекул воды промежуточных молекул, таких как анион супероксида, гидроксильный радикал и пероксид водорода (H2O2).
Полученные данные частично согласуются с исследованиями других авторов. Так, при исследовании ингибирующего действия АФК на различные показатели спермы млекопитающих (человека, быка, хряка и жеребца) были получены данные, свидетельствующие о том, что действие пероксида водорода не находится в прямой зависимости от видимых повреждений акросомы, нарушений структуры ДНК, целостности плазматической мембраны и функционального статуса митохондрий. Достоверно показано только ингибирующее действие пероксида водорода на показатели общей подвижности сперматозоидов и фертильности после цикла замораживания (оттаивания).
При анализе полученных данных наблюдали аналогичную взаимосвязь между уровнем внутриклеточного пероксида водорода и общей подвижностью замороженного (оттаянного) семени.
У петухов с высоким уровнем (>55,25%, Mср.) внутриклеточного пероксида водорода в свежеполученных эякулятах общая подвижность замороженного (оттаянного) семени была ниже в среднем на 24,6%, что говорит о непосредственном влиянии свободных радикалов на криорезистентность спермы (рис. 4.).
Коэффициент изменчивости содержания H2O2 в нативной сперме составил 18,18%, в замороженном (оттаянном) семени — 8,73%.
Выводы
Полученные экспериментальные данные позволяют сделать предположение, что продуцирование клетками повышенного количества активных форм кислорода, в частности пероксида водорода, в цикле замораживания (оттаивания) негативно сказывается на функциональном статусе митохондрий, которые являются основным источником энергии для сперматозоида, обеспечивающей работу кинетического аппарата сперматозоида и его общей подвижности.
Несмотря на увеличение уровня внутриклеточного H2O2 в процессе криоконсервации, определяющим значением для прогнозирования общей подвижности замороженного (оттаянного) семени является уровень АФК в клетках нативной спермы.
Полученные данные показывают достоверное влияние уровня внутриклеточного пероксида водорода в свежеполученных эякулятах на общую подвижность замороженного (оттаянного) семени (r = -0,65, р < 0,05).
Впервые получены данные по индивидуальной изменчивости содержания пероксида водорода в сперматозоидах петухов комбинированного направления продуктивности возраста 61 недели в цикле замораживания (оттаивания).
Коэффициент изменчивости внутриклеточного H2O2 в свежеполученных эякулятах составил 18,18%, что говорит о возможности отбора петухов по данному показателю с целью выявления особей с потенциально высокими показателями криорезистентности.
Данная информация может быть использована для возможной корректировки рациона петухов за счет введения кормовых антиоксидантов.
Об авторах
Антон Алексеевич Курочкин; младший научный сотрудник
kurochkin.anton.66@gmail.com
Татьяна Ивановна Кузьмина; главный научный сотрудник, профессор, доктор биологических наук
prof.kouzmina@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-4218-6080
Ольга Игоревна Станишевская; главный научный сотрудник, доктор биологических наук
olgastan@list.ru; https://orcid.org/0000-0001-9504-3916
Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных — филиал Федерального исследовательского центра животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, Московское шоссе, 55А, пос. Тярлево, Пушкин, Санкт-Петербург, 196625, Россия
УДК 636.018, 576.53
DOI: 10.32634/0869-8155-2024-385-8-132-138
Сельское хозяйство, ветеринария, зоотехния, агрономия, агроинженерия, пищевые технологии
