Снижение опасности токсинов фитопатогенов с помощью композиции органоминерального происхождения
Высокая контаминация микроскопическими грибами и их производными — микотоксинами — продовольственного сырья и пищевых продуктов является одной из основных проблем во всем мире. Микотоксины — это токсичные химические вещества, вырабатываемые такими видами грибов, как Fusarium, Alternaria, Aspergillus и Penicillium, которые либо фитотоксичны, либо вредны для здоровья человека и животных. Доказано, что борьба с фитопатогенами, вызывающими образование фузариотоксинов, является сложной из-за высокой распространенности продуцента и изменчивости генетического аппарата.
Биотрофные грибы фузариум извлекают питательные веществ из живых клеток и тканей организма хозяина за счет продуцирования ими токсинов и гидролитических ферментов, нарушающих метаболические пути на молекулярном, клеточном и организменном уровнях. Грибы рода Fusarium, продуцирующие микотоксины, являются основными патогенами в зерновых культурах, таких как пшеница, овес, ячмень и кукуруза. Вторичные метаболиты грибов, такие как фумонизины, Т-2 токсин, дезоксиниваленол (ДОН), зеараленон и другие, могут вызывать различные патологические процессы в организме животных и человека.
Зеараленон (ZEA) (ранее известный как токсин F-2) — это нестероидный эстрогенный микотоксин, нарушает репродуктивную функцию у млекопитающих. Наиболее чувствительными к зеараленону среди сельскохозяйственных животных являются свиньи. В настоящее время нет эффективного лекарственного препарата от данного токсина.
Токсическое действие ZEA на свиней связано с гипертрофией вульвы и яичников, но не с увеличением молочных желез и матки. При кормлении поросят и свиноматок рационом, содержащим 3,61 мг/кг ЗЕА, с периода полового созревания до стадии спаривания примерно у 45% этих свинок развились псевдобеременности, вызванные ZEA. Высокие концентрации ZEA индуцируют апоптоз и нарушают пролиферацию гранулезных клеток свиней дозозависимым образом. Опасность зеараленона заключается в том, что он вызывает нарушение трансмембранности митохондрий свиней.
Токсин Т-2 обладает липофильным характером и может немедленно всасываться из пищеварительного тракта или через слизистые оболочки дыхательных путей. Печень является основным органом метаболизма токсина после его всасывания. После приема внутрь токсин быстро всасывается и выводится с калом и мочой. Период полураспада Т-2 токсина в плазме короткий, элиминация обычно завершается в течение 48 часов в зависимости от режима введения потребляемого количества и видоспецифических различий.
В исследованиях in vitro с клетками печени животных и человека было показано, что Т-2 токсин слабо метаболизируется гепатоцитами в связи с нарушением ферментной секреции клеток.
Цель исследования — изучение влияния на первичную клетки печени метаболитов фитопатогенов зеараленона и Т-2 токсина в условиях in vitro на фоне применения защитных композиций органоминерального происхождения.
Материалы и методы исследования
Работа выполнена с января по июнь 2024 года на базе лаборатории кормов и кормовых добавок Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», Казань, Россия).
Объекты исследования: композиция органоминерального происхождения КМБИ-3 (ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», Россия), изготовлена из консорциума живых молочнокислых микроорганизмов Lactobacillus plantarum, спорообразующих бактерий Bacillus subtilis в среде культивирования; бентонит, полученный с месторождений, расположенный на территории Республики Татарстан; пиримидиновое основание (5-гидрокси-6-метилурацил). В 1 г КМБИ-3 содержится Lactobacillus plantarum — не менее 1 х 109 КОЕ (колониеобразующих единиц), Bacillus subtilis — не менее 1 х 109 КОЕ, бентонита — не менее 900 мг, 5-гидрокси-6-метилурацила — не менее 100 мг.
Для изучения защитной эффективности композиции органоминерального происхождения КМБИ-3 при сочетанном воздействии токсинов фитопатогенов в качестве модели использовали первичные клетки печени и микотоксины зеараленон и Т-2 токсин (ООО НПК «Эврика», Россия).
Первичные клетки печени выделяли из печени лабораторных крыс в лаборатории культур клеток и питательных сред ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» согласно общепринятой методике.
В опытах были использованы беспородные белые крысы, самцы и самки, с живой массой от 180 до 200 г. В опыт брали клинически здоровых животных, содержащихся на стандартном рационе и прошедших до начала эксперимента 14-дневный карантин.
Эксперименты на животных при получении первичных гепатоцитов проводили согласно правилам, изложенным в Директиве Европейского парламента и Совета Европейского союза и статье 4 ФЗ РФ № 498-ФЗ3.
Первичные клетки печени культивировались в среде DMEM («ПанЭко», Россия)с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки («ПанЭко», Россия)при 37 °С и 5% СО2. Клетки высевали в 96-луночные культуральные планшеты в концентрации 5000 кл/мл, выращивали в инкубаторе MCO-19AIC (Sanyo, Япония) во влажной атмосфере при температуре 37 °С и 5%. Зеараленон и Т-2 токсин растворяли в смеси ДМСО и 96%-ного спирта в соотношении 1:1.
Согласно концентрациям токсинов фитопатогенов проведено распределение на 13 экспериментальных групп клеток печени (контрольная группа и 12 опытных групп): 1-я группа — контрольная, содержащая монослой клеток печени, смесь ДМСО и 96%-ного спирта в соотношении 1:1 (без добавления зеараленона и Т-2 токсина); 2-я группа — опытная, содержащая клетки печени, защитную композицию, зеараленон и Т-2 токсин в дозах 1 х 10-6 и 1,07 х 10-9 М; 3–13-я группы — опытные, содержащие клетки печени, защитную композицию, зеараленон и Т-2 токсин в дозах 0,25 х 10-5 и 10,7 х 10-9, 0,5 х 10-5 и 21,5 х 10-9, 1 х 10-5 и 42,9 х 10-9, 0,25 х 10-4 и 6,4 х 10-8, 0,5 х 10-4 и 8,6 х 10-8, 1 х 10-4 и 10,7 х 10-8, 0,25 х 10-3 и 12,9 х 10-8, 0,5 х 10-3 и 1,5 х 10-7, 1 х 10-3 и 1,7 х 10-7, 2 х 10-3 и 1,9 х 10-7, 3 х 10-3 и 2,14 х 10-7 М соответственно (табл. 1).
Смесь зеараленона, Т-2 токсина и защитной композиции смешивали, выдерживали совместно в течение 6 часов и после экспозиции добавляли в среду с клеточным монослоем. Концентрацию композиции на бактериальной основе для исследований использовали в трех концентрациях: 0,4 мг/мл, 2 мг/мл и 4 мг/мл. После 24 часов культивирования клеточный слой оценивали по следующим параметрам: жизнеспособность клеток, форма и размер клеток, количество клеточных агрегатов, количество плавающих клеток. Подсчет клеток осуществляли в камере Горяева.
Пролиферативную активность клеточной культуры и ее жизнеспособность при совместном воздействии токсинов на фоне применения защитной композиции оценивали принятым методом окраски трипановым синим по количеству живых и мертвых клеток.
Цитотоксичность токсинов на фоне применения защитной композиции определяли по выживаемости культуры клеток методом МТТ-теста, как описано ранее.
Подсчет клеток проводили с помощью оптического микроскопа Zeiss Axio Vert.A1 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Германия). Влияние исследуемых соединений на культурально-морфологические свойства клеток определяли с учетом: коэффициента жизнеспособности — отношение живых клеток к общему их количеству (в %); индекса пролиферации — отношение числа выросших клеток к числу засеянных; процента гибели клеток — отношение мертвых клеток, оставшихся после экспозиции с соединением, к общему числу клеток после экспозиции с соединением.
Статистическую обработку полученных данных осуществляли методом вариационной статистики с применением критерия достоверности по Стьюденту программы Microsoft Excel (США). Достоверными считали различия показателей в сравниваемых группах при 95% доверительной вероятности (p ≤ 0,05).
Результаты и обсуждение
Основываясь на ранее полученных результатах по способности препарата КМБИ-3 к деструкции микотоксинов и об отсутствии токсичности в дозах 0,4 мг/мл, 2 мг/мл и 4 мг/мл, дальнейшие исследования были направлены на моделирование снижения токсичности микотоксинов зеараленона и Т-2 токсина на клетки печени. Жизнеспособность клеточной культуры печени при совместном воздействии зеараленона и Т-2 токсина на фоне применения защитной композиции КМБИ-3 представлена на рисунке 1.
Из рисунка 1 видно, что при воздействии зеараленона и Т-2 токсина на клеточную культуру жизнеспособность клеток во 2–5-й группах уменьшилась незначительно, в 6–13-й группах жизнеспособность клеток сократилась, соответственно, на 31,5%, 39,2%, 45,7%, 50,9%, 57,6%, 62,8%, 67,5% и 76,0% в сравнении с контролем. При использовании защитной композиции КМБИ-3 в дозе 4 мг/мл наблюдалось наименьшее отрицательное воздействие зеараленона и Т-2 токсина на клеточную культуру. Жизнеспособность клеток во 2–7-й группах уменьшилась незначительно, в 8–13-й группах жизнеспособность клеток снизилась, соответственно, на 27,3%, 30,9%, 34,0%, 38,7%, 43,0% и 50,8% в сравнении с контролем.
Пролиферативная активность клеточной культуры при совместном воздействии зеараленона и Т-2 токсина на фоне применения защитной композиции КМБИ-3 представлена на рисунке 2.
Из рисунка 2 видно, что при сочетанном воздействии зеараленона и Т-2 токсина на клеточную культуру пролиферативная активность во 2–6-й группах уменьшилась незначительно, в 7–13-й группах пролиферативная активность клеток уменьшилась, соответственно, на 18,7%, 25,1%, 34,3%, 43,8%, 51,9%, 63,0% и 78,4% в сравнении с контролем. При совместном использовании зеараленона, Т-2 токсина и защитной композиции КМБИ-3 пролиферативная активность клеточной культуры во 2–8-й группах снизилась незначительно, в 9–13-й группах пролиферативная активность клеток сократилась, соответственно, на 15,2%, 20,3%, 26,9%, 32,8% и 40,1% в сравнении с контролем.
Исход цитотоксических доз при сочетанном воздействии зеараленона и Т-2 токсина на фоне применения защитной композиции КМБИ-3 представлен на рисунке 3.
Из рисунка 3 видно, что при воздействии зеараленона и Т-2 токсина на клеточную культуру цитотоксичность во 2–6-й группах уменьшилась незначительно, в 7–13-й группах при воздействии зеараленона и Т-2 токсина наблюдалось понижение цитотоксического индекса, соответственно, на 18,7%, 24,6%, 32,0%, 41,0%, 58,7%, 64,0% и 78,4% в сравнении с контролем.
При воздействии зеараленона и Т-2 токсина на фоне использования композиции КМБИ-3 значительный положительный результат наблюдался при дозе 4 мг/мл. При совместном использовании Т-2 токсина и композиции КМБИ-3 цитотоксический индекс клеточной культуры во 2–8-й группах понизился незначительно, в 9–13-й группах величина цитотоксического индекса клеток сократилась относительно контроля на 17,1%, 24,3%, 30,5%, 38,0% и 45,1% соответственно.
Выводы
Изученные цитотоксические исследования токсинов фитопатогенов зеараленона и Т-2 токсина указывают на их способность снижать жизнеспособность, подавлять пролиферативную активность клеток в низких концентрациях.
Применение КМБИ-3 показало эффективное снижение цитотоксичности зеараленона и Т-2 токсина более чем на 40% после сочетанного воздействия. Кроме того, анализ цитометрии клеток показал, что применение препарата КМБИ-3 в дозе 4 мг/мл вызвало значительное повышение жизнеспособности клеток печени при токсическом воздействии зеараленона и Т-2 токсина.
Полученные данные открывают понимание перспектив использования защитных композиционных препаратов для борьбы с фитопатогенами, их высокотоксичными метаболитами в сельскохозяйственном производстве.
Об авторах
Ленар Рашитович Валиуллин1, 2; кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник1;кандидат биологических наук, научный сотрудник2
LRValiullin@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-2524-9609
Ринат Салаватович Мухаммадиев1; кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
tanirtashir@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-2524-9609
Андрей Иванович Самсонов1; кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник
andreykaz82@yandex.ru; https://orcid.org/
Айнур Ильнурович Яруллин1; кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник
abii@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-1717-0498
Данил Наильевич Мингалеев1; доктор ветеринарных наук, профессор, временно исполняющий обязанности директора
damin80@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-7217-4083
Юлия Варисовна Зуева1; младший научный сотрудник
zueva2310@mail.ru; https://orcid.org./0009-0000-3704-0055
Михаил Анатольевич Севостьянов2; кандидат технических наук, ведущий научный сотрудник
cmakp@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-2652-8711
Михаил Геннадьевич Барышев2; доктор биологических наук, профессор
vniif@vniif.ru; https://orcid.org/0000-0002-2130-3516
Асия Мазетдиновна Ежкова3; доктор биологических наук, профессор
egkova-am@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-5526-2214
1Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности, Научный городок — 2, Казань, 420075, Россия
2Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии, ул. Институт, 5 раб. пос. Большие Вязёмы, Одинцовский р-н, Московская обл., 5143050, Россия
3Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана, Сибирский тракт, 35, Казань, 420029, Россия
УДК 615.9: 632.4; 637.5; 615.099
DOI: 10.32634/0869-8155-2024-387-10-62-66
