Оценка аддитивного эффекта взаимодействия фитобиотиков с цинком на QuorumSensing P. aeruginosa на модели invitro
Условия повышения конкурентоспособности сельскохозяйственной продукции, направленные не только на увеличение продуктивности, но и на повышение качества готовой продукции, требуют от производителей использования различных кормовых добавок. Применение кормовых антибиотиков направлено на борьбу с биотическими стрессорами. Несмотря на очевидные преимущества, постоянное использование антибиотиков способствует развитию резистентности как условно-патогенных, так и патогенных микроорганизмов, что в конечном итоге послужило запретом на их использование.
В качестве альтернативы использования кормовых антибиотиков в настоящее время используются экологически чистые добавки, позволяющие избежать прямого и косвенного воздействия на водную экосистему и здоровье человека. Широкое использование фитобиотиков и экстрактов лекарственных трав в аквакультуре обусловлено их эффектами, стимулирующими рост, а также противовоспалительными и антиоксидантными свойствами.
Фитобиотики — это кормовые добавки растительного происхождения, которые богаты различными биологически активными соединениями (фитохимическими веществами) с высокой питательной и (или) нутрицевтической ценностью, что позволяет их использовать в качестве биостимуляторов для сельскохозяйственных целей.
Многие водные микроорганизмы обладают способностью к формированию биопленок, регуляция образования которых обусловлена системой Quorum Sensing. Чувство кворума (QS) — это система межклеточной коммуникации, основанная на плотности клеток, которая играет ключевую роль в регуляции бактериальной вирулентности и образовании биопленки. QS не только реагирует на изменения бактериальной популяции, но также может реагировать на сигналы стресса окружающей среды. Эту пластичность следует принимать во внимание при исследовании и разработке терапевтических средств против QS.
В научной литературе представлены данные о возможном формировании совместных эволюционных сообществ, в которых растения производят флавоноиды, которые функционируют для поддержания симбиотических бактерий за счет усиления QS, одновременно подавляя потенциальные патогенные микроорганизмы для ингибирования QS. Так, например, введение флавоноидов (флоретина, хризина и нарингенина) в культуру P. aeruginosa изменяет транскрипцию промоторов-мишеней, контролируемых определением кворума, и подавляет выработку факторов вирулентности, подтверждая их потенциал в качестве противоинфекционных средств, которые действуют за счет традиционных бактерицидных или бактериостатических механизмов.
Представленные в литературе данные по изучению свойств лигнанов (сезамина и сезамолина), выделенных из кунжута (Sesamum indicum L.), против P. aeruginosa в отношении антикворумного восприятия и антибиопленочных свойств на основании действия изучения механизмов лигнанов на пути QS по средству экспрессии гена QS и проведения анализа in silico, свидетельствуют о том, что выделенные лигнаны проявляют активность в отношении определения Quorum Sensing в концентрации 75 мкг/мл, не влияя на рост бактерий.
Было установлено снижение продукции факторов вирулентности, таких как пиоцианин, протеазы, эластаза и хитиназа. Лигнаны сильно повлияли на важные компоненты биопленки P. aeruginosa, включая альгинат, экзополисахариды и рамнолипиды.
Эфирные масла цитрусовых получили статус GRAS (международный нормативный статус безопасности пищевых продуктов) и могут использоваться в качестве антимикробных добавок для контроля бактериального кворума от потенциальных пищевых бактериальных патогенов. María C. Luciardi с соавт. были определены химический состав и ингибирующая активность эфирных масел Citrus paradisi (грейпфрута), полученных методом холодного отжима и методом холодного отжима с последующей паровой дистилляцией, в отношении Pseudomonas aeruginosa. Эфирные масла в концентрации 0,1 мг/мл не влияли на развитие бактерий, но ингибировали образование биопленки P. aeruginosa на 52–55%, жизнеспособность прикрепления — на 45–48%, продукцию аутоиндукторов и активность эластазы — на 30–56%. Лимонен был менее эффективен в ингибировании P. aeruginosa, чем эфирные масла, что свидетельствует о синергическом эффекте второстепенных компонентов.
Использование комплексов металлов для снижения или ингибирования факторов вирулентности Pseudomonas aeruginosa также является многообещающей стратегией лечения и контроля инфекций, вызванных этим патогеном с множественной лекарственной устойчивостью. Так, например, комплекс медь-CUR (комплекс пентагидрата сульфата меди (II) и куркумина) в концентрации 1/4 МПК (минимальная подавляющая концентрация) имеет наиболее выраженные ингибирующие характеристики на образование биопленок, продукцию альгината и пиоцианина.
Основываясь на вышеизложенном, была сформулирована цель проводимого исследования: оценить уровень аддитивного эффекта взаимодействия кормовых фитобиотиков в комплексе с цинком на Quorum Sensing бактериальной популяции клеток на модели P. aeruginosa в условиях in vitro.
Материалы и методы исследования
Экспериментальные исследования проводились на кафедре биохимии и микробиологии ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный университет» с января по февраль 2022 года.
В качестве объекта исследования использовался почвенный изолят штамма P. aeruginosa. Чистые культуры были получены методом высева суспензии почвенных образцов в разведении 10-5 с последующим пересевом и предварительной идентификацией на основании тинкториальных, морфологических и культуральных характеристик. Окончательная видовая идентификация осуществлялась методом матрично-активированной лазерной десорбции (ионизации) с времяпролетной масс-спектрометрией (MALDI ToF MS). Выбор данного микроорганизма обусловлен возможностью оценки воздействия тестируемых соединений на Quorum Sensing факторов (образование пигмента пиоцианина), обеспечивающих факторы вирулентности и рост биопленки.
В качестве факторов воздействия на QS-систему в эксперименте использовали следующие фитобиотические комплексы:
«Бутитан» — согласно инструкции эффективность биологического действия достигается вследствие синергетического эффекта экстракта сладкого каштана и бутирата кальция, входящих в состав кормовой добавки. Производитель «Танин Севница» (Словения). Входящие в состав экстракта сладкого каштана полифенолы повышают переваривание и всасывание питательных веществ, улучшают состояние слизистой желудочно-кишечного тракта и способствуют усилению кишечного иммунитета, что в свою очередь обеспечивает повышение производственных показателей в виде среднесуточного прироста.
«Пробиоцид®-Фито» — это комплекс на основе органических кислот и эфирного масла лемонграсса и пробиотических штаммов, способствующий формированию нормофлоры в желудочно-кишечном тракте и нормализации процессов пищеварения разработанный компанией ООО «Биотроф» (Россия). Входящие в состав препарата натуральные эфирные масла обладают выраженным антимикробным и антиоксидантным действием. Применение данной кормовой добавки снижает вероятность развития дисбактериоза у животных и птицы и повышает устойчивость к осложнениям, обусловленным стрессовыми ситуациями кормового и технологического характера.
«Интебио» — это натуральный заменитель кормовых антибиотиков на основе эфирных масел чеснока, лимона, чабреца и эвкалипта, разработанный в компании ООО «Биотроф» (Россия), для широкого применения как в птицеводстве, так и в животноводстве. Согласно опубликованным данным, данный фитобиотик обладает антимикробной, антиоксидантной и противовоспалительной активностью.
В качестве активатора антиQS-активности фитобиотических соединений использовали чистый для анализа (ЧДА) ZnSO4 ´ 7H2O.
Для реализации поставленной цели использовалось устройство для вырезания лунок в толще агаризованного субстрата, обеспечивающего равномерно удаленное распределение зон тестируемых концентраций фитохимических соединений и их комплексов с ZnSO4 ´ 7H2O. Комбинирование с методикой серийного разведения обеспечивало установление зон ингибирования роста, наличие аддитивного и кворум-зависимого эффектов на основании визуальной оценки степени влияния тестируемых веществ как на рост используемого в эксперименте микроорганизма (зона ингибирования и пигментации) в зависимости от тестируемой концентрации, полученной последовательным разведением фитобиотиков (100 мг/мл, 50 мг/мл, 25 мг/мл) и раствора ZnSO4 ´ 7H2O (0,500 мМ/мл, 0,250 мМ/мл, 0,125 мМ/мл, 0,0,63 мМ/мл, 0,031 мМ/мл, 0,016 мМ/мл, 0,008 мМ/мл).
Статистическую обработку экспериментальных данных осуществляли с использованием офисного программного комплекса Microsoft Office с применением программы Excel (Microsoft, США) с обработкой данных в Statistica 10.0 (Stat Soft Inc., США). Достоверность различий полученных результатов определяли по t-критерию Стьюдента.
Результаты и обсуждение
В рамках проводимых экспериментальных исследований по оценке аддитивного эффекта взаимодействия тестируемых фитобиотических препаратов в комбинации с катионами цинка в структуре соли ZnSO4 (выбор данного химического соединения обусловлен высокими показателями гидролиза) установлено, что все исследуемые препараты обладают выраженным действием на уровень пигментации исследуемого в работе изолята P. aeruginosa (рис. 1).
Следует отметить, что наиболее высокими показателями воздействия на QS-систему обладает фитобиотик «Пробиоцид®-Фито» на основе органических кислот и эфирного масла лемонграсса (Cymbopogon flexuosus) в концентрации 100 мг/мл по отношению к «Бутитану» (на 60,47%) и «Интербио» (на 30,19%) (табл. 1).
При оценке степени комбинированного действия исследуемых препаратов в комплексе с сульфатом цинка в концентрации 0,25 мМ/мл было установлено, что присутствие «Бутитана» и «Интербио» снижает уровень биологической активности цинка на 8,54% и 15,30% соответственно, в то время как присутствие препарата «Пробиоцид®-Фито» не оказывает влияния на антиQS-активность катионов цинка в отношении тестируемого штамма. Однако следует отметить, что все исследуемые комплексы в концентрации 100 мг/мл используемых препаратов имели более высокие показатели подавления пигментации (** р £ 0,01, *** р £ 0,001).
Сравнительный анализ эффективности тестируемых комплексов при снижении концентрации цинка до 0,125 мМ/мл и исследуемых препаратов до 50 мг/мл показал, что наиболее высокие показатели угнетения выработки пиоцианина регистрируются на фоне применения «Пробиоцид®-Фито» и составляют 7,6 мм диаметрально удаленного эффекта действия, в то время как на фоне применения «Бутитана» данный показатель составил 6,4 мм, а «Интербио» не оказал визуально подтверждающего действия.
Обобщая полученные в ходе экспериментальных исследований данные, следует отметить, что наиболее высокие достоверно значимые результаты по оценке эффективности антиQS-активности получены на фоне применения препарата «Пробиоцид®-Фито», одним из основных действующих веществ которого является эфирное масло Cymbopogon flexuosus (лемонграсс), которое, согласно литературным данным, обладает высокими противомикробными, инсектицидными и антиоксидантными свойствами, а также высокими ингибирующими характеристиками в отношении биопленкообразования (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Mycobacterium fortuitum (АТСС 6841), M. massiliense (АТСС 48898) и M. abscessus (АТСС 19977),
Выводы
Критериально значимым показателем в проводимых исследованиях являлась оценка степени влияния комбинированного взаимодействия тестируемых веществ на рост и Quorum Sensing (QS) системы P. aeruginosa. Устойчивость представителей данного вида микроорганизмов обусловлена их способностью к биопленкообразованию обусловленной межклеточной коммуникации (QS), данная система контролирует и продукцию различных протеолитических ферментов (протеазы типа IV, эластазы и щелочные протеазы), экзотоксины (экзотоксин А, экзоферменты и пиоцианин), сидеротрофы (пиовердин и пиохелин), рамнолипиды, цианистый водород и лейкины. Выработка данных веществ обусловливает уровень патогенности и резистентности. Полученные в ходе выполнения экспериментальных исследований данные свидетельствуют о выраженном влиянии как катионов цинка, так и тестируемых препаратов из группы «кормовых фитобиотиков» в исследуемых концентрациях (0,25 мМ/мл и 0,125 мМ/мл для ZnSO4 и 100 мг/мл для фитобиотиков) на продукцию пигмента пиоцианина. Наиболее высокими показателями биологической активности с точки зрения антиQS-эффективности (как в качестве однокомпонентного, так и в комплексе с соединениями цинка) обладает «Пробиоцид®-Фито» на основе органических кислот и эфирного масла лемонграсс (Cymbopogon flexuosus) и пробиотических штаммов микроорганизмов.
Об авторах
Елена Петровна Мирошникова; доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой биотехнологии животного сырья и аквакультуры,
elenaakva@rambler.ru; https://orcid.org/0000-0003-3804-5151
Азамат Ерсаинович Аринжанов; кандидат сельскохозяйственных наук доцент кафедры биотехнологии животного сырья и аквакультуры,
arin.azamat@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-6534-7118
Юлия Владимировна Килякова; кандидат биологических наук, доцент кафедры биотехнологии животного сырья и аквакультуры,
fish-ka06@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-2385-264X
Ольга Андреевна Черногорец; младший научный сотрудник
velsh.lelya@mail.ru
Алексей Николаевич Сизенцов; кандидат биологических наук доцент кафедры биохимии и микробиологии,
kwan111@yandex.ru; https://orcid.org/ 0000-0003-1099-3117
Оренбургский государственный университет, пр-т Победы, 13, корп. 2, Оренбург, 460018, Россия
УДК 579.243, 57.033, 57.042.2
DOI: 10.32634/0869-8155-2024-384-7-91-95
Сельское хозяйство, ветеринария, зоотехния, агрономия, агроинженерия, пищевые технологии
