Микробиологические показатели в рубце овец при скармливании разного уровня концентратов
Животноводство — динамично развивающаяся отрасль сельского хозяйства. Домашние жвачные являются важными животными — производителями белка и вносят огромный вклад в удовлетворение растущего спроса человека на высококачественную продукцию. В свою очередь, продуктивность и здоровье животных напрямую зависят от микроорганизмов в желудочно-кишечном тракте. Исследования M.-Y. Xue и соавт. продемонстрировали связь бактериального сообщества в рубце с продуктивностью молочных коров. За счет разложения и ферментации корма рубцовая микробиота обеспечивает организм микробиальным белком и витаминами, играя существенную роль в метаболизме животного-хозяина.
Микробиом рубца представляет собой сложную многофункциональную систему анаэробных микроорганизмов, состоящую из бактерий (около 95%), архей (2–5%) и эукариотов (до 1%), которые активно участвуют в процессе разложения компонентов корма. Бактерии являются крупнейшим компонентом микробной биомассы в рубце, их количество составляет 1010–1011 клеток/мл, разнообразие бактерий в рубце оценивается в 7000 видов, из которых около 30% до сих пор не идентифицированы.
Амилолитические бактерии расщепляют мальтозу и крахмал до муравьиной, уксусной и янтарной кислот. Целлюлозолитики расщепляют сложные углеводы до ди- и моносахаридов, а молочнокислые бактерии в свою очередь разлагают крахмал и сахара до молочной кислоты. Липолитические бактерии необходимы для разложения жиров до глицерина и жирных кислот (ЖК), в то время как протеолитики расщепляют белки и полипептиды до аминокислот (АК). На долю простейших может приходиться до 50% биомассы в рубце, но их роль в микробной экосистеме рубца не до конца изучена. Известно, что они измельчают и разрыхляют частицы корма, участвуют в процессах ферментации и азотистом обмене, а также способствуют механическому перемешиванию рубцовой жидкости за счет своей подвижности и относительно крупных размеров.
Грибы микробиома рубца, представленные шестью основными родами (Neocallimastix, Caecomyces, Piromyces, Anaeromyces, Orpinomyces и Cyllamyces), обладают целлюлозолитической активностью, сбраживают сахара, однако не являются обязательными участниками рубцовой экосистемы. Уникальной особенностью микробиоты рубца является ее синтрофное существование, при котором конечный продукт одного микробного консорциума используется другим. Побочные продукты анаэробной ферментации, такие как CO2 и H2, используются рубцовыми археями для образования метана.
На микробиом рубца влияют генотип, индивидуальные особенности и возраст животного, его физиологическое состояние, такое как лактация, а также рацион питания, при этом кормовые факторы оказывают доминирующее влияние на состав микробного консорциума рубца. При увеличении количества концентратов (особенно содержащих крахмал) в рационе увеличивается количество амилолитических бактерий за счет изменения соотношения субстратов. Они производят пропионат вместо ацетата, изменяя таким образом соотношение «ацетат — пропионат». Из-за изменения соотношения летучих жирных кислот (ЛЖК) уменьшается количество водорода, доступного метаногенным археям, и снижается pH рубца, что еще больше ингибирует рост популяции простейших и метаногенов.
Увеличение доли концентратов в рационе является одной из стратегий по снижению уровня выделения метана жвачными животными путем управления кормлением и питанием. Данная стратегия имеет научный и практический интерес и легко сочетается с другими способами снижения выделения CН4. В исследовании M. Schilde и соавт. продемонстрирован эффект синергизма концентратов и 3-нитрооксипропанола (3-NOP), который является ингибитором метаногенеза.
Цель работы — изучить влияние скармливания различного уровня концентрированных кормов на микробиоту рубца у овец.
Материалы и методы
Исследования, направленные на изучение влияния уровней концентратов на рубцовую микробиоту жвачных животных, проводились методом групп-периодов на баранчиках романовской породы в возрасте 2 лет в количестве 6 голов с живой массой 55 ± 2 кг с хроническими фистулами рубца по Басову в условиях физиологического двора и в лабораториях ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста в 2023 году.
Согласно схеме опыта, в первый период животным скармливали 20% концентратов, во второй — 30%, в третий — 40% концентратов от общей питательности рациона. Продолжительность каждого периода составляла 30 дней.
Основной рацион и условия содержания животных (температурный, влажностный и световой режимы, газовый состав воздуха в помещении) в исследуемые периоды были одинаковыми и в пределах зоогигиенических норм. Протокол исследования на животных был одобрен биоэтической комиссией ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста (протокол от 20 марта 2023 года № 2).
Эксперименты проведены с соблюдением требований, изложенных в Директиве Европейского парламента и Совета Европейского союза 2010/63/ЕС от 22 сентября 2010 года о защите животных, использующихся для научных целей, и принципов обращения с животными согласно статье 4 ФЗ РФ № 498-ФЗ.
В конце каждого балансового опыта у всех животных (n = 6) с помощью зонда отбирались пробы рубцового содержимого за 1 час до кормления и через 3 часа после кормления для исследования рубцовой микробиоты.
ПЦР-исследование проводили влаборатории фундаментальных основ питания сельскохозяйственных животных и рыб ФИЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста при сотрудничестве с лабораторией молекулярной генетики сельскохозяйственных животных, где за 1 час до кормления и через 3 часа после кормления в рубцовом содержимом определяли биомассу простейших и бактерий методом дифференцированного центрифугирования.
Для проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ)применяли комплект реагентов «Колонофлор-16 (премиум)» ООО «Альфалаб» (г. Санкт-Петербург, Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Интерпретацию результатов амплификации осуществляли согласно инструкции производителя. В процессе исследования были проанализированы 30 видов микроорганизмов, в том числе метаногены, общее бактериальное число и наличие генов патогенности, определяющих энтероинвазивные свойства E. Coli.
Видовую идентификацию микроорганизмов проводили по следующим критериям: оценка морфологии и результатов микроскопии колоний, выросших на дифференциально-диагностических средах; результаты биохимической идентификации на микробиологических средах (Himedia, Индия) и панелях тест-систем (BioMerieux, Франция):
молочнокислые микроорганизмы (лакто- и бифидобактерии) — МRS и «Бифидум-среда»;
бактерии рода кишечной палочки (БГКП) — «Агар Эндо-ГРМ»;
гемолитические организмы — мясопептонный агар (МПА) с добавлением 5% дефибринированной бараньей крови;
дрожжи и дрожжеподобные грибы — «Агар Сабуро» с добавлением 5% теллурита калия.
Морфологические свойства микроорганизмов определяли методом микроскопии по Граму, подсчет общего числа простейших — путем микроскопического подсчета в счетной камере Горяева.
Обработку полученных данных выполняли в программе Microsoft Exсel (США) с расширенным пакетом анализа данных и программы Statistica, version 13 Ru, StatSoft, Inc., 2011 (США). При этом вычислены следующие величины: среднеарифметическая (М) и среднеквадратическая ошибка (±m), уровень значимости (р). Сравнительный анализ групп проводили по Тьюки-Крамеру. Результаты исследований считали высокодостоверными при р < 0,001 и достоверными при р < 0,01, р < 0,05. При р < 0,1 до р > 0,05 — тенденция к достоверности полученных данных. При р > 0,1 разницу считали недостоверной.
Результаты и обсуждения
О течении микробиальных процессов в преджелудках свидетельствуют данные массы симбионтных микроорганизмов в рубцовом содержимом (табл. 1).
Содержание бактерий и простейших в исследовании изменяется в зависимости от количества вводимых концентратов. Так, к 3-му периоду численность бактерий составила 0,31 г / 100 мл, а простейших — 0,25 г / 100 мл, что на 0,05 и 0,03 г / 100 мл выше по количеству бактерий, на 0,04 и на 0,05 г / 100 мл ниже по количеству простейших по сравнению с 1-м и 2-м периодами, соответственно, до кормления животных. Через 3 часа после кормления наблюдается постепенное снижение количества бактерий с 0,37 до 0,32 г / 100 мл и увеличение простейших с 0,33 до 0,34 г / 100 мл. Повышение концентратов до 40% привело к снижению общей микробиальной массы на 6% и 7,5% по сравнению с 20% и 30% содержания концентратов в рационе соответственно.
Амилолитические бактерии, в основном стрептококки, представлены в рубце многочисленной группой. В данных опытах амилолитическая активность рубца после кормления постепенно увеличивалась (с 12,73 до 14,21 Е/мл) при смене рациона на более концентрированный.
Таким образом, результаты исследования показывают, что процент концентратов в рационе овец влияет на количественный и качественный состав микробиальной массы рубца. Данный факт в свою очередь влияет на характер ферментации и использование питательных веществ.
Бактерии играют ключевую роль в разложении полимерных углеводов в рационе животных. Фибролитические бактерии, такие как Fibrobacter succinogenes и Ruminococcus flavefaciens, специализируются на расщеплении полисахаридов целлюлозы и гемицеллюлозы. Кроме того, амилолитические и лактат-использующие бактерии способствуют расщеплению крахмала и сахара, обеспечивая эффективное использование источников энергии в рубце [19]. Увеличение доли концентратов в рационе способствует замене бактерийFirmicutes и Fibrobacteres, разлагающих клетчатку, на амилолитические виды микробов Bacteroidetes и Proteobacteria.
Была проведена оценка динамики изменения количества микробиальной массы рубца при скармливании животным низко- и высококонцентратного рациона путем высева десятикратных разведений на дифференциально-диагностические среды. Проведен сравнительный анализ групп по Тьюки-Крамеру. Полученные результаты представлены в таблице 2.
Стоит отметить, что количественное соотношение некоторых групп микроорганизмов до и после кормления сохраняется. Так, наименьшее количество энтерококков (4,19 lgКОЕ/мл) наблюдается при низкоконцентратном рационе до кормления, 4,63 lgКОЕ/мл — после. С увеличением доли концентратов происходит рост популяции данных микроорганизмов с максимумом при 30% концентратов (4,32 lgКОЕ/мл до кормления и 5,12 lgКОЕ/мл через 3 часа после кормления). Достоверных различий между группами до кормления (A, C, E) и после (B, D, F) не обнаружено. Количество лактобактерий значительно увеличивается при переходе на высококонцентратный рацион за счет увеличения доли поступающих в организм углеводов. Лактобактерии в рубце ферментируют моносахара до молочной кислоты, снижая pH рубца, что в свою очередь способствует угнетению активности метаногенных архей.
До кормления наибольшее количество данной группы бактерий (4,53 lgКОЕ/мл) наблюдалось при 40% концентратов, однако после кормления рост популяции лактобактерий при скармливании 30% концентратов был более интенсивным по сравнению с высококонцентратным рационом (5,67 lgКОЕ/мл против 5,48 lgКОЕ/мл). Наблюдаются достоверные различия между группами A, C и E (табл. 2). Соотношение КМАФАнМ до и после кормления оставалось постоянным с выраженным максимумом при 30% концентратов. Стоит отметить, что были обнаружены достоверные различия между всеми изучаемыми группами по данному показателю. Не удалось обнаружить устойчивую закономерность в изменении количества грибов в рубце при разном уровне концентратов в рационе.
Грибы рубца не являются обязательными обитателями и у некоторых животных не обнаруживаются. Тем не менее они обладают очень высоким потенциалом разложения клетчатки, поскольку кодируют множество ферментов, разрушающих растительные волокна. Количество дрожжеподобных грибов увеличивалось с переходом на более концентрированные рационы, однако интенсивность их роста значительно отличалась.
Установлены достоверные различия между группами «A — C» и «C — E». Количество плесеней при 20% и 40% концентратов после кормления значительно снижалось, в то время как при 30% наблюдался рост популяции данных микроорганизмов.
Наиболее противоречивые данные были получены по содержанию целлюлозолитических бактерий. Увеличение доли концентратов в рационе способствует изменению соотношения субстратов для рубцовой микробиоты, что приводит к снижению числа целлюлозолитиков и росту популяции амилолитиков. При увеличении количества концентратов (особенно содержащих крахмал) в рационе снижается количество целлюлозолитических бактерий и увеличивается количество амилолитических бактерий за счет изменения соотношения субстратов.
Однако, по данным авторов, наблюдается значительный рост количества целлюлозолитических бактерий при скармливании 40% концентратов, в то время как при 20% и 30% концентратов в рационе их содержание изменяется незначительно, что требует дальнейшего изучения.
Была проанализирована динамика изменения состава рубцовой микробиоты овец романовской породы с увеличением концентратов на 20%, 30% и 40% методом ПЦР-РВ (рис. 1).
Количество Lactobacillus spp. при потреблении 30 и 40% концентратов выросло, соответственно, на 14,6% и 12,4% относительно низкоконцентратного рациона, количество же Bifidobacterium spp. с увеличением доли концентратов снизилось на 5,1%. Наибольшая численность Bacteroides spp. наблюдается при 30% концентратов и составляет примерно 8,6•1011. Аналогично количество Prevotella spp. и Roseburia inulinivorans при низко- и высококонцентратном типе кормления оставалось неизменным, однако наблюдался рост данных бактерий при скармливании 30% концентратов.
С увеличением ввода концентратов увеличивается количество Lactobacillus spp., Bacteroides spp., Blautia spp., Streptococcus spp., Roseburia inulinivorans, Prevotella spp., при этом снижается количество Bifidobacterium spp., Methanobrevibacter smithii, Methanosphaera stadmanae, Ruminococcus spp. в рубцовом содержимом, что в целом характерно для сеноконцентратного типа кормления. Prevotella, Butyrivibrio и Ruminococcus, а также неклассифицированные Lachnospiraceae, Ruminococcaceae, Bacteroidales и Clostridiales являются основными видами бактерий в рубце, и изменения в рационе могут влиять на общую структуру их сообщества. Prevotella и неклассифицированные Succinivibrionaceae,вероятно, являются основными производителями пропионата и сукцината (предшественника пропионата), поэтому ответственны за более высокие уровни пропионата, образующегося в результате диеты, богатой концентратами, что наблюдается в данных исследованиях.
Производство метана в рубце в первую очередь связано с метаболической активностью метаногенных архей, которые представляют собой специализированные микроорганизмы, генерирующие метан в качестве побочного продукта. Яркие примеры метаногенных архей, обнаруженных в рубце, включают Methanobrevibacter smithii, Methanosphaera stadtmanae, Methanomirobium mobileи Methanosarcina spp. Эти археи используют H2, CO2 и метанол для синтеза метана. Однако определенные виды бактерий в рубце вносят свой вклад в процесс ферментации, предоставляя субстраты, поддерживающие метаногенез.
В данных исследованиях с увеличением уровня концентратов снижается количество основных метаногенов, а именно Methanobrevibacter smithii, Methanosphaera stadtmanae. Наиболее зависящими от концентратного типа кормления оказались Methanobrevibacter smithii.Их количество заметно сократилось в рубцовом содержимом при вводе 40% концентратов.
В целом полученные данные путем высева на дифференциально-диагностические среды (табл. 2) соотносятся с результатами, от метода ПЦР (рис. 1). Наибольшее количество микробиальной массы наблюдается при скармливании 30% концентратов.
Выводы
Амилолитическая активность рубцовой жидкости после кормления постепенно увеличивалась с 12,73 до 14,21 Е/мл при смене рациона на более концентрированный. Повышение в рационе концентратов до 40% привело к снижению общей микробиальной массы на 6% и 7,5% по сравнению с 20% и 30% содержания концентратов в рационе соответственно.
Метагеномный анализ показал увеличение количества Lactobacillus spp., Bacteroides spp., Blautia spp., Streptococcus spp., Roseburia inulinivorans, Prevotella spp. при снижении количества Bifidobacterium spp., Methanobrevibacter smithii, Methanosphaera stadmanae, Ruminococcus spp. в рубцовом содержимомс увеличением концентратов на 20%, 30% и 40%. С увеличением уровня концентратов снизилось количество метаногенов Methanobrevibacter smithii, Methanosphaera stadtmanae в рубце.
Полученные методом ПЦР-РВ данные соотносятся с результатами высева на дифференциально-диагностических средах. Наибольшее количество микроорганизмов наблюдается при скармливании животным 30% концентратов.
Об авторах
Никита Сергеевич Колесник; младший научный сотрудник лаборатории фундаментальных основ питания сельскохозяйственных животных и рыб
kominisiko@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-4267-5300
Алёна Анатольевна Зеленченкова; старший научный сотрудник, заведующая лабораторией фундаментальных основ питания сельскохозяйственных животных и рыб, кандидат сельскохозяйственных наук
aly4383@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-8862-3648
Полина Сергеевна Вьючнаяэ; младший научный сотрудник лаборатории фундаментальных основ питания сельскохозяйственных животных и рыб
vyuchnaya@gmail.com; https://orcid.org/0009-0008-4669-2395
Ольга Анатольевна Артемьева; ведущий научный сотрудник, заведующая лабораторией микробиологии, кандидат биологических наук
vijmikrob@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-7706-4182
Федеральный исследовательский центр животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, пос. Дубровицы, 60, г. о. Подольск, Московская обл., 142132, Россия
УДК 612.32:579:636.32/.38+636.32./38.084.085.54
DOI: 10.32634/0869-8155-2024-384-7-85-90
Сельское хозяйство, ветеринария, зоотехния, агрономия, агроинженерия, пищевые технологии
