Изменение метаболических параметров рубцового содержимого в результате преобразования отходов маслоэкстракционных производств в системе непрерывной ферментации
В настоящее время при организации переработки отходов маслоэкстракционных производств крайне низкой является эффективность использования побочных продуктов сельского хозяйства, таких как лузга, шелуха, и некоторых других отходов, содержащих трудноперевариваемую клетчатку. Тем не менее состав этих отходов позволяет рассматривать их как перспективное сырье для пищевой промышленности и животноводства.
Главные проблемы — низкая биологическая доступность питательных веществ этих растительных субстратов и негативное влияние на микробиоту рубца за счет содержания большого количества жира и лигнина. В связи с этим ожидаемо, что перспективные решения по наращиванию производства продовольствия в ближайшие годы станут возможными через создание промышленных технологий, построенных на принципах работы пищеварительного аппарата жвачных, являющихся интересным источником устойчивого консорциума микроорганизмов, способных перерабатывать растительные отходы со значительным содержанием некрахмалистых полисахаридов.
Прийти к осуществлению этой непростой задачи можно благодаря совершенствованию уже существующих систем непрерывного культивирования различных конструкций, моделирующих пищеварение рубца жвачных (Rumen continuous fermenter, RCF). Данные аппараты в настоящее время используются для оценки влияния состава корма, кормовых добавок и рациона на синтез микробного белка, пищеварение и процессы ферментации, осуществляемые в инокуляте рубца жвачных животных.
Важным преимуществом ферментеров непрерывного культивирования in vitro является способность удалять конечные продукты ферментации и поддерживать относительно стабильную ферментацию в течение длительного периода времени. Основные недостатки таких систем — накопление непереваренных материалов в ферментационных колбах, трудности с поддержанием микробного разнообразия и постоянства среды инокулята рубца, близких к in vivo и т. д.
За 60-летнюю историю с начала разработки первого аппарата ферментации непрерывного культивирования учеными был сделан большой шаг для преодоления недостатков работы данных устройств, но тем не менее не все проблемы были решены.
Моделирование «идеального» биореактора, поддерживающего и воспроизводящего условия среды и естественное микробное сообщество рубца жвачного животного, является актуальной задачей и может дать начало передовой природоподобной технологии, производящей такие конечные продукты ферментации, как летучие жирные кислоты, водород и метан, которые могут использоваться в качестве прекурсоров для производства биотоплива или в качестве биотоплива.
Таким образом, совершенствование конструкции ферментера непрерывного действия не только даст возможность преобразования отходов сельского хозяйства благодаря внедрению в биотехнологическую промышленность принципов работы пищеварения жвачных, но и поможет приблизиться к изучению структуры и функционирования экосистемы сложного консорциума микроорганизмов, обитающих в преджелудках животного-хозяина.
Цель исследования — проанализировать изменения инокулята рубцовой жидкости в результате преобразования льняного жмыха в условиях непрерывной работы биореактора в течение продолжительного времени.
Материалы и методы
Исследования проводили с 04.2021 по 05.2023 на базе отдела кормления сельскохозяйственных животных и технологии кормов им. профессора С.Г. Леушина ФГБНУ «Федеральный научный центр биологических систем и агротехнологий Российской академии наук» (Оренбург, Россия).
Объекты исследования — растительные отходы масложировой промышленности: льняной жмых по ГОСТ 10974 (Самарская область, Россия), ферментированная рубцовая жидкость.
Отбор рубцовой жидкости для загрузки в биореактор производили из рубца быков казахской белоголовой породы при убое (убойный цех мясоперерабатывающего комбината «Мегаторг», х. Чулошников, Оренбургская обл., Россия). Полученную рубцовую жидкость помещали в термосы объемом 3 л, транспортировку осуществляли в течение 30 минут.
Группой соавторов совместно с ООО «Основа» (г. Москва, Россия) была разработана конструкция биореактора (рис. 1), продолжительность ферментации в котором составляла 20 суток непрерывной ферментации без дополнительного добавления субстрата.
Установка состоит из реактора, представляющего собой цилиндрическую емкость, с рабочим объемом 100 л с конусным дном и нижним выпуском. Рамная мешалка с плавающими скребками из фторопласта и наклонными серповидными лопастями встроена внутрь емкости.
Ферментер был заполнен на 80% от объёма емкости (V = 100 л), причем 2/3 этого объема загружали опытными образцами растительных субстратов. Ферментация осуществлялась в биореакторе на таком растительном субстрате, как льняной жмых (отход масложировой промышленности).
Образцы льяного жмыха подвергались высушиванию (сушильный шкаф) (Binder, Германия) (+60 °C) до константного веса, в последующем проводился анализ химического состава до и после ферментации.
Рубцовая жидкость представляла жидкую часть ферментера и была получена от бычков казахской белоголовой породы возрастом 15 месяцев с хронической фистулой рубца (n = 4).
Рацион кормления подопытных животных составлялся с учетом рекомендаций и включал: сено разнотравное — 47,4%, сено бобовое — 32,6%, зерновую смесь — 19%, минеральный премикс — 1,0%. В рационе: сухое вещество — 94,7%, сырой протеин — 5,9%, сырая клетчатка — 28%, НДК — 6,3%, КДК — 4,6%, гемицеллюлоза — 1,65%, сырой жир — 2,73%, органическое вещество — 93,4%, Са — 0,51%, Р — 0,37%.
Корм скармливался животным два раза в день, при этом они имели свободный доступ к питьевой воде.
Сбор рубцовой жидкости у фистульных животных проводился через 3 часа после кормления. Транспортировка осуществлялась в термосе в течение 30 мин. с терморегуляцией на уровне +38,5–39,0 °С. Фильтрация рубцовой жидкости была выполнена через 4 слоя марли с последующим смешиванием с буферным раствором солей (имитирующим слюну) в соотношении 1:4.
Буферный раствор выполняет функции слюны и поддерживает рН ферментера, близкую к физиологической. Буферный раствор состоит из: KH2PO4,MgSO4*7H2O, NaCl, CaCl2*2H2O, Na2CO3, Na2S*9H2O, мочевины. Раствор перед смешиванием был подогрет до +39 °С и насыщен СО2.
Содержание животных и процедуры при выполнении экспериментов соответствовали требованиям инструкций и рекомендаций по выполнению биологических исследований. При проведении исследований были предприняты меры, чтобы свести к минимуму страдания животных и уменьшить количество исследуемых опытных образцов.
На 4-е, 7-е и 14-е сутки инкубации проводился отбор рубцового содержимого ферментера с последующим отцеживанием данной жидкости через 4 слоя марли и немедленной отправкой в лабораторию для определения уровня летучих жирных кислот (ЛЖК) и форм азота.
Уровень ЛЖК в рубцовом содержимом ферментера определялся методом газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектированием на хроматографе газовом «Кристаллюкс-4000М» (СКБ «Хроматек», Россия). Определение форм азота производилось по ГОСТ 26889.
Массовую долю сухого вещества образцов до и после ферментирования определяли по ГОСТ 31640, сырого протеина — по ГОСТ 13496.4, массовую долю сырого жира — по ГОСТ 13496.15, массовую долю сырой клетчатки — по ГОСТ 31675, массовую долю сырой золы — по ГОСТ 26226.
Микробиальную массу определяли методом дифференцированного центрифугирования (мини-центрифуга, 100–15 000 об/мин) (MIULAB, Китай) с последующим высушиванием (сушильный шкаф) (Binder, Германия), основанным на различиях в скорости седиментации частиц, отличающихся размерами и плотностью.
Для осаждения бактерий использовали центрифуги с фактором разделения около 7000 (9–10 тыс. об/мин). Чистую осадочную фракцию взвешивали, определяли бактериальную массу.
Численные данные были обработаны с помощью программы SPSS Statistics 20 (IBM, США), рассчитывали средние (М), среднеквадратичные (±σ) отклонения, ошибки стандартного отклонения (±SE). Для сравнения вариантов использовали непараметрический метод анализа. Различия считали статистически значимыми при р ≤ 0,05, р ≤ 0,01.
Результаты и обсуждение
Перед загрузкой в биореактор был проведен химический анализ испытуемого образца льняного жмыха (табл. 1). Сравнение результатов анализа химического состава льняного жмыха до и после ферментации позволило установить понижение массовой доли сухого вещества на 47,3%, сырого белка — на 14%, сырой золы — на 47%, жира — на 77,4% в испытуемом ферментируемом образце.
K.J. Soder et al. (2013 г.) наблюдали снижение усвояемости сухого вещества и клетчатки в рубце при использовании в рационе на основе фуража 10% льняного жмыха в системе непрерывного культивирования. Как правило, содержание липидов в рационе около 5% не должно вызывать какого-либо вредного дисбаланса в среде рубца и вряд ли негативно скажется на усвояемости. В настоящем in vitro исследовании при непрерывной ферментации льняного жмыха с содержанием жира до 12,8% зафиксировано снижение разложения сырой клетчатки.
Для определения эффективности синтеза микробного белка при разложении льняного жмыха была оценена концентрация метаболитов азота в инокуляте ферментера. Концентрация общего азота, обнаруженная в исследовании, аналогична концентрации в ранее опубликованных исследованиях. На 7-е сутки ферментации наблюдалось увеличение уровня общего азота в рубцовом содержимом относительно 4-х суток на 75,8%, при этом на 14-е сутки наблюдалось снижение данного показателя на 22,2% относительно 7-х суток (рис. 2).
Аналогичная тенденция выявлена в отношении концентраций белкового и небелкового азота в инокуляте рубцовой жидкости. Так, было отмечено возрастание данных метаболитов на 7-е сутки инкубации относительно 4-х суток на 76,5% и 2,2 раза, соответственно, с дальнейшим понижением концентрации на 14-е сутки относительно 7-х суток на 20,4% и 16%.
Более ранние исследования показали, что концентрация общего азота в рубце ниже 8,5 мг% может потенциально угнетать синтез микробного белка. Наблюдаемая авторами концентрация азота в содержимом ферментера в данном исследовании указывает на то, что доступность азота не ухудшала рост микроорганизмов.
В исследованиях с включением льняного жмыха в объеме 4,1% в рацион жвачных не было отмечено изменений в синтезе ЛЖК и их соотношении. Однако при увеличении части льняного жмыха в рационе до 10% и более, было зафиксировано изменение соотношения пропорций отдельных ЛЖК, в частности ацетата и пропионата.
В данном исследовании было отмечено повышение концентрации пропионовой и масляной кислоты на 7-е сутки инкубации рубцового содержимого в реакторе в 2,1 и 3 раза относительно 4-х суток (рис. 3). В свою очередь, на 14-е сутки наблюдалось понижение масляной и пропионовой кислоты по сравнению с 7-ми сутками на 25,5% и 27,4% соответственно.
Показатель концентрации уксусной кислоты на 7-е сутки инкубации вырос относительно результатов 4-х суток на 36,5%, затем к 14-м суткам данная концентрация снизилась на 25,4 % по сравнению с 7-ми сутками. Концентрация валерьяновой и капроновой кислоты на протяжении всего времени ферментации оставалась на незначительном уровне.
Пик увеличения биомассы бактерий в содержимом ферментера наблюдался на 7-е сутки инкубации, концентрация бактерий в 2,8 раза превышала значения 4-х суток ферментации (рис. 4). На 14-е сутки инкубации инокулята рубцового содержимого отмечено незначительное снижение числа микроорганизмов (на 22,6%) относительно 7-х суток.
Выводы
Непрерывная ферментация льняного жмыха в биореакторе в течение 14 суток показала способность данного субстрата поддерживать активность рубцовой микробиоты для переваримости питательных компонентов.
В результате расщепления льняного жмыха отмечено сохранение достаточно высокого уровня летучих жирных кислот и метаболитов азота в инокуляте рубца, а также увеличение переваримости сухого вещества, сырого жира, сырого протеина в данном кормовом средстве.
Об авторах
Елена Владимировна Шейда1, 2; научный сотрудник, кандидат биологических наук1; старший научный сотрудник, кандидат биологических наук2
elena-shaejjda@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-2586-613X
Галимжан Калиханович Дускаев1; ведущий научный сотрудник, доктор биологических наук
gduskaev@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-9015-8367
Сергей Александрович Мирошников1; член-корреспондент РАН, доктор биологических наук
https://orcid.org/0000-0003-1173-1952; fncbst@mail.ru
Мария Сергеевна Аринжанова1; младший научный сотрудник, аспирант
https://orcid.org/0000-0003-1898-9307; marymiroshnikova@mail.ru
Дмитрий Александрович Проскурин1; научный сотрудник, кандидат технических наук
https://orcid.org/0000-0001-7030-0912; dimitrpro@mail.ru
1Федеральный научный центр биологических систем и агротехнологий Российской академии наук, ул. 9 Января, 29, Оренбург, 460000, Россия
2Оренбургский государственный университет, пр-т Победы, 13, Оренбург, 460000, Россия
УДК 664;57.088.5
DOI: 10.32634/0869-8155-2024-385-8-82-87
Сельское хозяйство, ветеринария, зоотехния, агрономия, агроинженерия, пищевые технологии
