Подписаться на нашу рассылку

    Комментарии

    Характеристика цитотоксичности нативного цеолита в отношении эпителиальных клеток крупного рогатого скота

    Для восполнения организма  с/х животных в макро-и в макроэлементах нашли  широкое  применение нетрадиционные источники минеральных веществ

    Важным условием роста производимой продукции животноводства является наличие устойчивой кормовой базы. В настоящее время большой интерес представляют цеолиты, которые в РФ исчисляются миллиардами тонн, а при скармливании — повышают продуктивность животных.

    Федеральным законом,  который вступил в действие 1 января 2020 года, №280-ФЗ от 3 августа 2018 года «Об органической продукции и о внесении изменений в отдельные законодательные акты Российской Федерации» предусмотрено выполнение определенных требований при производстве. Анализ российского рынка показал, что доля органической продукции составляет около 20%, 5% из которых животного происхождения. Стремительно набирает обороты в плане получения органической продукции и молочная отрасль.

    Ключевым вариантом получения органической продукции животноводства может быть создание высокоэффективных кормовых добавок из природного сырья, кремнийсодержащих минералов – цеолитов.

    Немаловажным аспектом, регламентирующим применение сорбентов в сельскохозяйственной практике, является характеристика их токсического воздействия на организм продуктивных животных. Отечественными учеными был проведен значительный объем токсикологических исследований разных типов цеолитовых пород большинства разведанных месторождений. Цитотоксические эффекты могут быть обусловлены несколькими факторами: так, например, высокую канцерогенную активность некоторых цеолитов связывают с их морфологией, фиброгенную и мутагенную активность, повышенную естественную радиоактивность – с особенностями месторождений. Установлено, что токсичность цеолитов напрямую зависит от размеров их частиц: нано- и микрочастицы оказывают большее повреждающее действие на живой организм ввиду их соизмеримости с размерами клеток. Интересны и некоторые свойства цеолитов для сохранения биоценоза. Цеолит известен и своими антимикробными свойствами.

    Учитывая то, что состав цеолитов чрезвычайно вариабелен, в том числе и по содержанию микроэлементов, большинство отечественных цеолитовых туфов не оценено с точки зрения возможной цитотоксичности.

    Целью настоящего исследования явилась характеристика цитотоксичности нативного клиноптилолита в отношении эпителиальных клеток крупного рогатого скота.

    Материалы и методы

    Для характеристики цитотоксичности были отобраны 4 фракции цеолита, с размерами частиц: № 1 – 0,2 мм, № 2 – 0,24 мм, № 3 – 0,8 мм, № 4 – 0,8-2,5 мм, с одного из действующих в Республики Татарстан Татарско-Шатрашанского месторождения.

    Используемая в опытах порода имела следующий химический состав (%): SiO общ. — 53,62; Al2O3 — 5,95; Fe2O3 — 1,78; CаO – 16,16; MgO -2,14; K2O -1,22; P2O5 — 0,08; Na2O — 0,02; Zn — 0,003; Cr -0,010; Ni — 0,004; Co — 0,001; Mo — 0,00015; Cu — 0,002; Pb — 0,0014; As — 0,00015; Cd — 0,005; Hg- 0,000006. Минеральный состав был следующим (%): клиноптилолит – 22; опал-кристобалит – 23,3; монтмориллонит – 13; кальцит – 12.

    Для определения цитотоксичности готовили суспензии цеолитов на поддерживающей среде DMEM в концентрациях 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000 мкг/мл; Для недопущения контаминации культур клеток суспензии цеолитов подвергали автоклавированию при 2 атм. в течение 1 ч.

    В качестве моделей для определения токсичности цеолитов были выбраны две перевиваемые клеточные линии: LEK (эпителий лёгкого эмбриона коровы) и TR (эпителий трахеи эмбриона коровы), полученные из Коллекции культур клеток позвоночных (ИЦиГ РАН, Россия). Клетки выращивали на среде DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone, США), пенициллина и стрептомицина (по 100 МЕ/мл), 20 мМ глутамина (Sigma-Aldrich, США) в 96-луночных планшетах (Costar, США) при +37 ºС в атмосфере 5 % CO2. Клетки выращивались при первоначальной посевной концентрации 103 кл. на лунку в течение 24 ч до достижения 95 % конфлюэнтности монослоя, после чего ростовую среду заменяли на суспензии цеолита в соответствующих концентрациях. Срок инкубации клеточных монослоев с образцами цеолитов составлял 24 ч. В качестве отрицательного контроля служили интактные клеточные монослои.

    Жизнеспособность клеток оценивали по активности митохондриальной дегидрогеназы по стандартной методике, основанной на восстановлении тетразолиевого красителя МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид). Цеолитовые суспензии в лунках заменяли на раствор МТТ в среде DMEM (5 мг/мл) и инкубировали при +37 ºС в течение 4 ч. После удаления раствора МТТ в лунки вносили по 200 мкл ДМСО, выдерживая в темноте в течение 15 мин для растворения кристаллов формазана. Показания оптической плотности считывали на ИФА-ридере при длине волны 570 нм. Долю живых клеток определяли по соотношению оптической плотности в опытных и контрольных лунках.

    Статистическая обработка данных производилась при помощи ПО GraphPad Prism 6.0 (США). Эксперименты проводились в 5 повторах, за статистически достоверный уровень принимали p≤0,05.

    Результаты и обсуждение

    МТТ-тест позволил охарактеризовать различия, касающиеся влияния исследуемых фракций клиноптилолита на метаболическую активность клеток эпителия легкого и трахеи эмбриона крупного рогатого скота. Результаты представлены в виде гистограммы, в которой жизнеспособность клеток, культивируемых в питательных средах с добавлением цеолитовых суспензий, выражена в процентах по отношению к контролю (рис. 1А-Г).

    Из представленных диаграмм видно, что концентрации 50-300 мкг/мл не являются цитотоксическими для цеолитов фракций № 1 – № 4; при обработке концентрациями в диапазоне 400-1000 мкг/мл доля апоптотических клеток увеличивается от 10,4±2,1% (фракция № 1) до 23,85±3,17% (фракция № 4) по сравнению с интактными клеточными образцами (p<0,01).      

    При сопоставлении показателей, полученных при обработке цеолитовыми суспензиями клеток линий LEK и TR, статистически значимых различий между ними зарегистрировано не было, что может быть объяснено общностью их морфологии.

    Сведения о цитотоксическом воздействии разных фракций цеолитов на клетки организма продуктивных животных в дальнейшем лягут в основу их токсикологической оценки и позволят выработать стратегию их безопасного применения.

    Выводы

    При проведенном исследовании была изучена базовая цитотоксичность цеолита Дрожжановского района Республики Татарстан в отношении культуры клеток легкого и трахеи эмбриона крупного рогатого скота (LEK, TR). Установлено, что фракции цеолита №1 — №4 могут быть использованы для производства кормовых добавок.  Было выявлено, что концентрации всех фракций цеолитов до 300 мкг/мл не оказывают цитотоксического эффекта на исследуемые клетки.

    Цитопатогенное действие проявляется в диапазоне концентраций 400-1000 мкг/мл и находится в прямой корреляции с размером цеолитовых частиц – доля клеток в состоянии апоптоза составляет до 35,23±2,3%, что, вероятно, связано с механическим воздействием крупных частиц рассматриваемых пород на клеточные структуры.

    Авторы

    Альберт Николаевич Чернов, доктор биологических наук, заведующий отделом животноводства и ветеринарии, главный научный сотрудник Татарский научно-исследовательский институт агрохимии и почвоведения — обособленное структурное подразделение Федерального исследовательского центра Казанский научный центр Российской академии наук, 2/31 ул. Лобачевского, Казань, 420111, Российская Федерация https://orcid.org/0000-0002-9007-5641 Тел.: 927-403-63-00. E-mail: rt-kazan@mail.ru  

    Дэниел Мавуена Афордоаньи, кандидат биологических наук, научный сотрудник Татарский НИИАХП — обособленное структурное подразделение ФИЦ КазНЦ РАН, Татарский НИИСХ — обособленное структурное подразделение ФИЦ КазНЦ РАН, 2/31 ул. Лобачевского, Казань, 420111, Российская Федерация Тел. 917-236-39-46. E-mail: dafordoan@gmail.com

    Елена Александровна Прищепенко, кандидат с/х наук, руководитель Татарский НИИАХП — обособленное структурное подразделение ФИЦ КазНЦ РАН, Татарский НИИСХ — обособленное структурное подразделение ФИЦ КазНЦ РАН, 2/31 ул. Лобачевского, Казань, 420111, Российская Федерация Тел. 8(843)2778274. Е-mail: niiaxp2@mail.ru

    УДК 619:616-092.9 DOI: 10.32634/0869-8155-2022-361-7-8-40-43

    Журнал «Аграрная наука»

    Сельское хозяйство, ветеринария, зоотехния, агрономия, агроинженерия, пищевые технологии

    0 Комментарий
    Межтекстовые Отзывы
    Посмотреть все комментарии
      ПОДПИШИТЕСЬ
      БЕСПЛАТНО
      на электронную версию журнала «Аграрная наука» и получайте ежемесячно pdf на свой e-mail.

        Нажимая на кнопку Вы соглашаетесь с политикой обработки персональных данных