• Зоотехния и ветеринария
• Научные исследования

01.10.2024

Экспериментальная оценка взаимосвязи индигенного состава микрофлоры кишечника и элементного статуса карпа обыкновенного (Cyprinus caprio) на фоне применения новой кормовой добавки

Аквакультура — интенсивно развивающаяся отрасль во всем мире и представляет собой важный источник пищи для населения. Удовлетворение пищевых потребностей в микронутриентах является физиологически значимой частью питания рыб и, как следствие, обеспечивает их здоровье.

В настоящее время применяются разные подходы для обеспечения устойчивости рыб к заболеваниям различной этиологии и повышения их продуктивности. Один из перспективных методических подходов — изучение микробиома рыб в качестве устойчивой альтернативы для улучшения методов аквакультуры.

Микробиом в организме рыб выполняет разнообразные физиологически значимые функции, изучение последнего и практический опыт его корректировки позволят не только улучшить здоровье, продуктивность, но и повысить пищевые характеристики конечной продукции.

Согласно литературным данным, к автохтонной микрофлоре кишечника пресноводных рыб можно отнести представителей филогенетических групп Proteobacteria, Fusobacteria, Firmicutes и Bacteroidetes, присутствие которых способствует активному разложению растительных полимеров, ферментации органических соединений, что в конечном итоге обеспечивает организм хозяина питательными веществами и энергией.

Несмотря на то что ряд микроорганизмов обладают фактором патогенности для одних видов рыб, для других они могут выступать в качестве пробиотического компонента. Так, например, некоторые представители рода Aeromonas обладают выраженными целлюлозоразлагающими характеристиками, Cetobacterium участвуют в продукции цианкобламина и в изобилии присутствуют в кишечном тракте Cyprinus caprio.

Так, бактерии рода Vibrio выступают в качестве доминирующей факультативной микробиоты кишечника различных морских рыб. Способность специфических бактерий занимать места прикрепления в личиночном кишечнике, препятствуя размножению и колонизации условно-патогенными бактериями, является важным защитным механизмом, особенно на ранних личиночных стадиях, когда иммунная система еще не полностью сформировалась.

В ходе проведенных исследователей установлено, что присутствие бактерий рода Vibrio значительно увеличивает содержание отдельных первичных метаболитов, таких как тимин, аденин, гуанин, кафестол, кортизол, валин, пролин, серин, лизин лейцин, аденин, глутамин, пролин, пиперидин, гуанозин и пропионовая кислота. Появление в структурном микробиоме симбиотических бактерий рода Bradyrhizobium и Mesorhizobium, как правило, обусловлено всеядностью рыб, так как данные родовые группы связаны с корнями растений, выступающих в качестве корма.

В литературе представлены данные о том, что представители Actinobacteria производят различные вторичные метаболиты, многие из которых — сильнодействующие антибиотики.

Филогенетические группы Firmicutes и Bacteroidetes являются основными агентами, обеспечивающими бактериальную деградацию целлюлозы в эвтрофных местообитаниях с нейтральным рН, тогда как Actinobacteria доминируют в аэробной деградации целлюлозы в сфагновых торфяниках в кислых условиях (рН) от 3,5 до 5,5.

Fibrobacter spp. являются основными целлюлозоразрушающими бактериями в рубце, в то время как аналогичная функция установлена у представителей Bacillus, Vibrio, Aeromonas и Enterobacter в кишечнике белого амура. Установлено, что целлюлозоразлагающей активностью обладают Anoxybacillus, Leuconostoc, Clostridium, Actinomyces Streptococcus и Prevotella.

Согласно литературным данным, присутствие в структуре кишечного микробиома микроорганизмов рода Nitrobacter, Rhodobacter и Roseomonas обеспечивает активное разложение нитратов и пестицидов. Представители рода Paludibacter обладают ферментативным метаболизмом и способны расщеплять олигофруктозу (рафтилозу P95), тип Planctomycetes участвует в деградации полисахаридов. Cyanobacteria являются важным источником пищи для некоторых видов рыб, у хищных рыб участвуют в переваривании белков. Chitinophagales участвуют в разложении хитина и ряда органических веществ. Lactobacillus активно участвуют в расщеплении полиненасыщенных жирных кислот, способствуют метаболизму глюкозы и липидов у рыб-хозяев.

Цель работы — оценить степень влияния двух новых кормовых добавок на видовое разнообразие резидентной микрофлоры кишечника карпа обыкновенного с использованием метода метагеномного секвенирования.

Материалы и методы исследований

Исследования были проведены в условиях аквариумного стенда кафедры биотехнологии животного сырья и аквакультуры Оренбургского государственного университета в 2022 году.

Объекты исследований — годовики карпа, выращенные в условиях ООО «Ирикла-рыба» (Оренбургская обл., Россия).

Для проведения исследований методом пар-аналогов были сформированы 3 группы (n = 20). После подготовительного периода (7 суток) животные были переведены на условия учетного периода (56 суток).

Контрольная группа получала основной рацион (ОР), I опытная группа — ОР + кормовую добавку «Интебио» (2 г/кг), II группа — ОР + кормовую добавку «Бутитан» (2 г/кг).

В качестве основного рациона был использован корм КРК-110-1 производства ОАО «Оренбургский комбикормовый завод» (Россия).

Кормовая добавка «Интебио» является натуральным заменителем кормовых антибиотиков. Основу препарата составляют эфирные масла чеснока, лимона, чабреца и эвкалипта. Данный препарат разработан в компании ООО «Биотроф» (Россия) для широкого применения (как в птицеводстве, так и в животноводстве) и обладает антимикробной, антиоксидантной и противовоспалительной активностью.

Кормовая добавка «Бутитан» (Tanin Sevnica d. d. Словения) — препарат, эффективность биологического действия которого, согласно инструкции, достигается вследствие синергетического эффекта бутирата кальция и экстракта сладкого каштана, составляющих основу препарата.

Содержание и убой экспериментальных рыб проводили в соответствии с инструкциями Russian Regulations, 1987 (Order No.755 on 12.08.1977 the USSR Ministry of Health) и The Guide for Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press Washington, D. С., 1966). При выполнении исследований были приняты усилия, чтобы свести к минимуму страдания животных и уменьшить количество используемых образцов.

Для оценки степени влияния изучаемых кормовых добавок на микробиом кишечника использовали метод метагеномного секвенирования. Исследовали образцы содержимого кишечника, полученные в ходе убоя исследуемой рыбы. ДНК выделялась и очищалась по модифицированной методике.

Для построения спектров оптической плотности и оценки чистоты препарата ДНК (по OD260/OD280) использовали спектрофотометр NanoDrop (Thermo Scientific, США), для измерения концентрации (нг/мкл) — флуориметр Qubit 2.0 (Invitrogen/Life Technologies, США). Концентрация ДНК измерялась троекратно: после выделения ДНК, после первой полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специфичными 16S прокариотическими праймерами, после второй ПЦР с адаптерами и индексами протоколов Nextera XT.

Анализ микрофлоры осуществлялся методом метагеномного секвенирования (Illumina MiSeq, Illumina, США) с набором реагентов MiSeq® Reagent Kit v3 (600 cycle). Для биоинформатической обработки результатов была использована программа PEAR (Pair-End AssembeR, PEAR v0.9.8, США). Результаты секвенирования обработаны с использованием пакета программ Microsoft Excel (версия Windows 2019, разработчик Microsoft, США).

Для определения элементного состава мышечной ткани использовали метод атомно-эмиссионной и масс-спектрометрии (АЭС-ИСП и МС-ИСП) на оборудовании Elan 9000 (Perkin Elmer, США) и Optima 2000 V (Perkin Elmer, США).

Статистическую обработку экспериментальных данных осуществляли с использованием офисного программного комплекса Microsoft Office с применением программы Excel (Microsoft, США) с обработкой данных в Statistica 10.0 (Stat Soft Inc., США).

Достоверность различий полученных результатов определяли по t-критерию Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

В ходе проведенного исследования было уставлено, что основными представителями индигенной микрофлоры кишечника карпа в контрольной группе являются филогенетические группы: Proteobacteria (40,5%), Actinobacteria (28,6%), Firmicutes (19,1%) и Bacteroidetes (10,2%) (рис. 1).

Однако следует отметить, что на фоне применения кормовых добавок происходит существенное перераспределение основных групп микроорганизмов, формирующих автохтонную микрофлору. Так, уровень Proteobacteria на фоне применения препарата «Интебио» увеличился до 72,2%, что на 31,7% превышает показатели группы интактных рыб. В группе, где применялся «Бутитан», данный показатель составил 62,7%, превышающий показатели контрольных значений на 22,2%.

Использование метода метагеномного секвенирования позволило определить распределение Proteobacteria до уровня основных родовых групп (рис. 2), что предоставило возможность оценить степень влияния изучаемых кормовых добавок на микроорганизмы, формирующие основную филогенетическую группу резидентной микрофлоры. Так, в интактной группе к основным представителям Proteobacteria (более 5%) можно отнести Polynucleobacter (17,6%), Schlegelella (7,3%). В диапазоне от 1 до 5% содержались представители следующих родов: Bradyrhizobium — 1,08%, Caulobacter — 1,29%, Bosea — 1,49%, Aeromonas — 2,72%, Pseudaeromonas — 4,96%. На фоне применения препарата «Интебио» родовое распределение Proteobacteria, выделенное из содержимого кишечника, выглядело следующим образом: основные представители — Aeromonas (23,87%), Vibrio (21,27%), Caulobacter (8,57%), Schlegelella (6,15%), Bradyrhizobium (4,01%), Pseudaeromonas (2,17%), Propionivibrio (1,95%), Enhydrobacter (1,67%), Pseudomonas (1,35%).

Представленные данные свидетельствуют о существенном различии родового распределения в наиболее обширной филогенетической группе, что в свою очередь проявляется в виде существенного сдвига процентного соотношения по сравнению с показателями интактной группы (рис. 1).

Модельный эксперимент по применению «Бутитана» выявил значительные различия не столько в качественном, сколько в количественном распределении основных родовых групп Proteobacteria. Так, на долю рода Aeromonas в данной группе приходится 35,67% от всего видового разнообразия резидентной микрофлоры, в отличие от показателей интактной группы, где данный показатель составил 2,72%.

Доля Pseudaeromonas составила 13,69%, что на 8,73% больше по отношению к контрольным значениям. 1%-ный барьер (более 148,85 выделенных таксономических групп) превысили Polynucleobacter (1,68%), Acinetobacter (2,06%), Caulobacter (3,38%), Schlegelella (3,75%). Следует отметить, что в данной группе были идентифицированы роды в структуре филогенетической группы, отсутствующие в контрольной группе (Shewanella, Acinetobacter, Enhydrobacter, Acidibacter, Acidovorax, Dechloromonas, Propionivibrio иLawsonia).

Возвращаясь к анализу общего распределения структурного микробиома на уровне филогенетических групп (рис. 1), следует отметить, что в опытных группах наряду с видовым разнообразием регистрируются и значительные различия в численности выделенных таксонов из кишечника исследуемых групп (табл. 1). У интактных рыб (Cyprinus carpio) среднее значение данного показателя составило 16 958 таксонов, что на 0,11% ниже, чем в группе с применением «Интебио», и на 12,22% выше количества таксонов на фоне применения кормовой добавки «Бутитан».

Представленные в таблице 1 данные свидетельствуют о значительном влиянии добавок на микрофлору кишечника исследуемых рыб. Так, на фоне применения препарата «Интебио» наряду со значительным увеличением Proteobacteria регистрируется высокий уровень содержания таксономической филогенетической группы Fusobacteria (14,83%), представленных родом Cetobacterium. При этом следует отметить, что данная филогенетическая группа не выделена из микробиома кишечника интактной группы.

Основная доля содержания Actinobacteria (7,52%) представлена родами Aurantimicrobium (4,40%), Cutibacterium (1,59%) и Micrococcus (1,02%), в то время как на долю Aurantimicrobium в контрольной группе приходится 23,87%.

В опытной группе с применением в качестве кормовой добавки «Бутитан» уровень содержания Actinobacteria составил 9,10% с относительно равномерным распределением между родами Rubrobacter (2,18%), Corynebacterium (1,76%), Micrococcus (1,64%), Cutibacterium (1,53%) и Aurantimicrobium (1,14%).

К основной автохтонной филогенетической группе микробиома кишечника можно отнести Bacteroidetes, так как на ее долю приходится 10,28% от общего числа выделенных из кишечника таксонов. Основными родами, формирующими данную группу, являются Flavobacterium (2,47%) и Hydrotalea (7,66%).

Аналогичная картина регистрируется и в опытной группе на фоне применения препарата «Бутитан», однако следует отметить более высокие значения данного показателя (табл. 1). Соответственно, на долю Flavobacterium и Hydrotalea в данной группе приходится 4,75% и 16,24%, а общая численность представителей данной филогенетической группы составляет 21,07%.

Для оценки уровня взаимодействия между представителями структурного микробиома был проведен анализ корреляционной зависимости (табл. 2).

Представленные в таблице 2 данные свидетельствуют о высоком уровне взаимодействия между основными таксономическими группами, формирующими микробиом кишечника рыб, о чем свидетельствуют более 85% результатов с различным уровнем достоверности (р £ 0,05, р £ 0,01).

Более детальный анализ корреляционной зависимости позволяет с высокой долей достоверности констатировать наличие прямой зависимости между Proteobacteria с Fusobacteria, Verrucomicrobia и Campilobacterota (р £ 0,01). Fusobacteria с Spirochaetes, Verrucomicrobia и Campilobacterota (р £ 0,01). Firmicutes и Actinobacteria (р £ 0,01), Verrucomicrobia с Spirochaetes и Campilobacterota (р £ 0,01). Spirochaetes с Campilobacterota (р £ 0,01).

Обобщая вышеизложенное, следует отметить, что к категории индигенной микрофлоры кишечника исследуемых рыб (Cyprinus carpio) можно отнести Proteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes и Bacteroidetes. Представители данных филогенетических групп независимо от типа в совокупности имеют наиболее высокие показатели и составили в интактной группе 98,44% от общего числа таксонов, 82,19% в группе с применением «Интебио» и 96,81% на фоне применения «Бутитана» соответственно.

Рыба является одним из основных продуктов питания, где наряду с белковым, жировым, витаминным и аминокислотным компонентами, обеспечивающими полноценное поддержание организма человека на физиологическом уровне, немаловажное значение отводится микро- и макроэлементам с высоким уровнем биологической доступности.

Корректировка элементного статуса тела рыб — важный биотехнологический подход, обеспечивающий население эндемичных территорий жизненно важными элементам. Резидентная микрофлора кишечника активно участвует в обменных процессах, в том числе и элементном обмене, формируя биологически доступные формы, связывая их с различными белковыми и липидными молекулами, образуя лигандные комплексы.

Основываясь на этом, было проведено исследование распределения макро- и микроэлементов в теле исследуемого карпа в зависимости от типа кормления (табл. 3, 5).

Анализ системного распределения ключевых макроэлементов (табл. 3) в теле карпа (Cyprinus carpio) на фоне применения кормовых добавок свидетельствует о выраженной положительной динамике исследуемых элементов в группе применения «Бутитана». В данной тестируемой группе зарегистрировано значительное увеличение кальция (на 135,06%) (p £ 0,001), калия (на 45,95%) (p £ 0,05), магния (на 22,99%) (p £ 0,05), натрия (на 5,97%) и фосфора (на 57,85%) (p £ 0,01).

Применение «Интебио» оказывает стимулирующее действие на накопление отдельных макроэлементов, однако достоверно значимое различие установлено только в отношении Ca (на 51,39%) (p £ 0,05). Уровень содержания K и P превышал значения интактной группы на 6,51% и 22,59% соответственно. Однако следует отметить, что концентрация Mg в тканях была идентична показателям интактной группы, а содержание натрия снизилось на 20,52% по отношению к контрольным значениям.

Для определения степени взаимодействия показателей автохтонной микрофлоры кишечника с содержанием различных элементов в тканях рыбы был проведен анализ корреляционной зависимости (табл. 4, 6).

Полученные данные (табл. 4) свидетельствуют о наличии выраженной прямой зависимости между элементами. В частности, содержание кальция достоверно (p £ 0,01) коррелирует с калием, магнием и фосфором, уровень калия — с магнием, фосфором (p £ 0,01), натрия (p £ 0,05), магния — с натрием (p £ 0,05) и фосфором (p £ 0,01).

Положительные динамические характеристики взаимодействия между резидентной микрофлорой и содержанием элементов в тканях установлены у представителей филогенетической группы Bacteroidetes в отношении всех исследуемых макроэлементов: Ca (p £ 0,05), K (p £ 0,01), Mg (p £ 0,01), Na (p £ 0,01), P (p £ 0,05). Обратная достоверная зависимость в отношении исследуемых элементов установлена у Spirochaetes.

В отношении других филогенетических групп микроорганизмов, формирующих автохтонную микрофлору кишечника исследуемых рыб (Cyprinus carpio), проведенный анализ не выявил выраженных структурных взаимодействий, как у Bacteroidetes и Spirochaetes. Однако следует отметить, что в большинстве случаев преобладает обратная зависимость. Так, Actinobacteria отрицательно коррелирует с кальцием (p £ 0,01), калием (p £ 0,05), магнием и фосфором (p £ 0,01). Аналогичную картину имеет Firmicutes, в отношении которого установлены достоверные отрицательные значения по тем же элементам (табл. 4).

Степень распределения эссенциальных элементов в тканях исследуемых рыб (табл. 5), как и в случае с макроэлементами, свидетельствует о более выраженном биологическом действии добавки «Бутитан» в дозе 2 г / 1 кг корма. Уровень распределения исследуемых эссенциальных элементов в данной группе имел более высокие значения по отношению к аналогичным показателям интактной группы.

Следует отметить достоверно значимые различия (p £ 0,01) содержания меди, марганца и цинка — на 93,67%, 108,0% и 55,79% соответственно. Концентрация железа и селена в данной группе превысила контрольные значения на 44,13% и 5,88% соответственно.

На фоне применения препарата «Интебио» в концентрации 2 г / 1 кг корма было установлено достоверно значимое увеличение концентрации меди (на 88,61%) (p £ 0,01) и марганца (на 45,83%) (p £ 0,05) в теле исследуемой рыбы по отношению к показателям контрольной группы. Содержание железа (1,63%) и цинка (26,68%) имело более высокие показатели в сравнении с интактными значениями. Однако следует отметить, что в данной группе регистрируется незначительное снижение селена (на 5,88%) в сравнении с контрольными показателями.

Анализ корреляционной зависимости свидетельствует о высоком уровне прямой зависимости распределения эссенциальных элементов в теле рыб. Так, медь достоверно коррелирует с железом (p £ 0,05), марганцем (p £ 0,01) и цинком (p £ 0,01). Железо в свою очередь обладает высоким уровнем взаимодействия (p £ 0,01) с марганцем, селеном и цинком. Марганец положительно коррелирует с селеном (p £ 0,05) и цинком (p £ 0,01). Отрицательной зависимости между исследуемыми элементами не установлено.

При оценке степени взаимодействия между резидентной микрофлорой и микроэлементами установлена положительная корреляционная зависимость между филогенетической группой Bacteroidetes и всеми определяемыми элементами с достоверно значимым уровнем взаимодействия с железом (p £ 0,01), марганцем (p £ 0,05)  и селеном (p £ 0,01). Установлена прямая взаимосвязь между Proteobacteria и медью (p £ 0,01), марганцем и цинком (p £ 0,05). Наличие отрицательной зависимости между Spirochaetes и исследуемыми эссенциальными элементами свидетельствует о том, что на фоне снижения уровня данной филогенетической группы в микробиоме кишечника возрастает уровень усвоения исследуемых элементов из корма.

Обобщая вышеизложенное, следует отметить, что использование кормовых добавок оказывает существенное влияние на процессы усвоения из рациона микро- и макроэлементов.

Представленные в литературе данные свидетельствуют о наличии прямой взаимосвязи избыточного содержания отдельных микроэлементов с резидентной микрофлорой кишечника. Так, например, биоаккумуляция селена привела к сдвигу в составе микробиома, в значительной степени обусловленному обогащением Bacteroides plebeius, что связано с расщеплением сульфатированных полисахаридов водорослей.

Высокие динамические характеристики усвоения элементов гипотетически могут быть обусловлены следующими механизмами. Во-первых, кормовые добавки могут стимулировать рост ворсинок в кишечнике (увеличение высоты и ширины), что увеличивает не только поверхность всасывания питательных веществ, но и способствует увеличению доли симбиотной микрофлоры с опосредованным влиянием на ростовые характеристики. Во-вторых, микроорганизмы обладают высокими биоаккумулирующими характеристиками, что в совокупности определяет более высокую долю формирования лигандных комплексов элементов или наноструктурных компонентов, обладающих более высоким уровнем биологического потенциала взаимодействия с макроорганизмом.

Выводы

Наиболее близкие по отношению к контролю показатели по распределению таксономических групп, формирующих микробиом кишечника, зарегистрированы на фоне применения препарата «Бутитан», однако следует отметить значительное перераспределение между уровнем выделяемых таксонов, а также значительное снижение общего количества идентифицированных микроорганизмов.

На фоне применения «Интебио» регистрируется значительное увеличение численности Proteobacteria за счет родов Aeromonas, Vibrio, Caulobacter и Schlegelella, показатели которых значительно превышали показатели интактной группы.

Следует отметить, что существенный вклад в формирование микробиома в данной опытной группе внесли представители рода Cetobacterium, входящие в филум Fusobacteria, на долю которого приходится 14,83%, в отличие от контрольный группы, где данные микроорганизмы не были идентифицированы в ходе исследования.

Проведенный корреляционный анализ позволил установить наличие выраженной прямой зависимости между филогенетической группой Bacteroidetes как с макроэлементами (Ca (p £ 0,05), K (p £ 0,01), Mg (p £ 0,01), Na (p £ 0,01), P (p £ 0,05), так и с микроэлементами (Fe (p £ 0,01), Mn (p £ 0,05), Se (p £ 0,01).

Анализ полученных данных с высокой долей уверенности позволяет констатировать значительное влияние тестируемых добавок на показатели индигенной микрофлоры. Значительное перераспределение, как между основными филогенетическими группами, так и между родами внутри них, гипотетически может быть обусловлено высоким уровнем влияния на системы коммуникативного взаимодействия между различными видами микроорганизмов, участвующих в процессах переваривания пищи, метаболической и иммунологической активности.

Одним из возможных факторов влияния является чувствительность отдельных представителей микробиома к активным веществам, входящим в состав тестируемых в эксперименте препаратов «Интебио» и «Бутитан», что в конечном итоге приводит к субингибированию микроорганизмов, обладающих выраженными антагонистическими характеристиками, что в конечном итоге приводит к значительному изменению показателей резидентной микрофлоры кишечника.

Общей положительной динамикой на фоне применения обоих кормовых добавок является их высокая биологическая активность в отношении грибов (Ascomycota и Fungi incertae sedis), которые регистрировались только в образцах интактной группы.

Об авторах

Алексей Николаевич Сизенцов; доцент кафедры биохимии и микробиологии, кандидат биологических наук

asizen@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-1099-3117

Елена Петровна Мирошникова; заведующая кафедрой биотехнологии животного сырья и аквакультуры, доктор биологических наук, профессор

elenaakva@rambler.ru; https://orcid.org/0000-0003-3804-5151

Азамат Ерсаинович Аринжанов; доцент кафедры биотехнологии животного сырья и аквакультуры, кандидат сельскохозяйственных наук

arin.azamat@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-6534-7118

Юлия Владимировна Килякова; доцент кафедры биотехнологии животного сырья и аквакультуры, кандидат биологических наук

fish-ka06@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-2385-264Х

Оренбургский государственный университет, пр-т Победы, 13, корп. 20, Оренбург, 460018, Россия

УДК 639.371.5, 639.3.043.13
DOI: 10.32634/0869-8155-2024-385-8-88-95