Подписаться на нашу рассылку

    Комментарии

    Чувствительность штаммов, выделенных из дальневосточных природных популяций ризобий, к антибактериальным препаратам

    Соесеющий регион Российского Дальнего Востока – это единственный регион в России, где в почвах обитают самые северные в мире природные популяции ризобий.

    Основным ограничением при изучении природных популяций в целом является сложность в идентификации штаммов в их естественной среде обитания. Длительное время считалось, что образование клубеньков на корнях сои происходит только одним видом клубеньковых бактерий – Rhizobium jponicum. Чистые культуры Rhizobium jponicum имели строгие параметры культуральных и биохимических свойств, и если у выделенных культур микроорганизмов эти параметры не совпадали, то их выбраковывали.

    В результате использования современных методов определения генетического родства при изучении клубеньковых бактерий представления о ризобиях стали меняться. Из рода Rhizobium было выделено два самостоятельных рода — Bradyrhizobium и Sinorhizobium.

    Обнаружение в конце прошлого века при исследовании группы штаммов Bradyrhizobium jponicum, различающихся по ДНК-ДНК гибридизации послужило основанием для описания нового вида ризобий Bradyrhizobium elkanii. Данное обстоятельство, в свою очередь, позволило предположить, что в почвах Дальнего Востока РФ, среди широкого разнообразия видов ризобий обитают и Bradyrhizobium elkanii. Поэтому на опытном участке лаборатории с 2012 года высевались различные зернобобовые культуры: вигна 3-х видов (Vigna radiate, Vigna unguiculata, Vigna angularis), арахис (Arachis hypogaea), нут (Cicera rientinum, Cicera reticulatum), люпин (Lupinus luteus),чина (Lathyrus), лобиа (Dolichos), горох (Pisum sativum), бобы (Vaciafaba L.), чечевица (Lensculinaris), а так же различные виды фасоли.

    Имеется достаточно методов определения характеристик и идентификации штаммов. Например, по составу жирных кислот, анализу метиловых эфиров (FAME), или с помощью системы Biolog.

    Kuykendall et al. при изучении двух гомологичных групп Bradyrhizobium разделили их по составу жирных кислот на 2 группы – I и I1. Штаммы группы I были чувствительны к рифампицину, тетрациклину, стрептомицину, эритромицину, карбенициллину и налидиксовой кислоте, тогда как штаммы группы I1 были в основном устойчивы к этим антибиотическим препаратам. Поэтому он предположил, что метод определения устойчивости ризобий к антибиотикам может быть использован для идентификации вида B.elkanii, так как является простым методом оценки генетической изменчивости в группах выделенных штаммов популяции Bradyrhizobium spp. Это подтверждается работами и других исследователей.

    Поэтому целью исследований являлось определить резистентность выделенных из природных популяций штаммов Bradyrhizobium elkanii к антибиотическим веществам.

    Материал и методы исследования

    Объектами исследований являлись чистые культуры новых штаммов ризобий, выделенные из корневых клубеньков различных зернобобовых культур.

    В фазы цветения – плодообразования отбирали растения вигны (Vigna radiate, Vigna unguiculata иVigna angularis), выращиваемых на луговых черноземовидных почвах Амурской области с хорошо развитыми клубеньками на корнях. Клубеньки отмывали от почвенных частиц и помещали в фарфоровые тигли с сетчатым дном (тигель Гуча). Тигель последовательно погружали на одну минуту в чашки: 1) с 96% этиловым спиртом; 2) с 0,5% раствором сулемы; 3) с 96% этиловым спиртом. На заключительном этапе клубеньки промывали большим количеством стерильной воды. Простерилизованные клубеньки переносили в пробирки с 1 мл стерильной воды и раздавливали. Из полученной суспензии делали истощающий микробиологический посев в чашки Петри с агаризованной питательной средой МРС, следующего состава г /л: NaCl – 0,2; соль Mo – следы; маннит или лактоза – 20,0; соевая мука – 10,0; агар – 20,0. Засеянные чашки Петри выдерживали в термостате при температуре +26…+28С0. Отдельные, наиболее типичные колонии ризобий пересевали для идентификации в пробирки с агаризованной средой МРС с маннитом, лактозой, а также на МПА следующего состава г/л: агар сухой питательный – 20,0; агар – 10,0. В пробирках со средой МРС, у 3-7 суточных культур фиксировали интенсивность роста, окраску и консистенцию штриха. Рост штриха на питательной среде МРС оценивали в баллах: 4- обильный, 3-хороший, 2-умеренный, 1- скудный, 0 –нет роста. Рост бактериальной массы на питательной среде МПА оценивали: + — наличие роста и н — нет роста.

    Вирулентность новых штаммов ризобий, выделенных в чистую культуру из клубеньков различных зернобобовых культур определяли методом выращивания бактеризованных семян в пробирках диаметром 20 и высотой 200 мм с питательной средой для растений следующего состава, г/л: K2HPO4 – 1,0; MgSO4 – 1,0; CaCO3 – 0,5; FeSO4, MnSO4, H3BO3, молибдат аммония – следы. В качестве субстрата использовали фильтровальную бумагу. В каждую пробирку вносили 30 мл питательной среды для растений. Стерильные семена (стерилизуются концентрированной серной кислотой 2 минуты и промываются большим количеством стерильной воды) раскладывали в подготовленные пробирки и обрабатывали 1 мл суспензии изучаемых штаммов из расчета 1 млн.клеток ризобий на семя. На каждый испытываемый штамм использовали не менее 10 пробирок. Через 25-30 суток после закладки опыта учитывали количество клубеньков на корнях каждого растения. По наличию клубеньков определяли вирулентность, а по их количеству – интенсивность образования клубеньков за счет изучаемого штамма. Достоверность проверяли по отсутствию клубеньков на корнях растений в контрольных пробирках без инокуляции.

    Определение чувствительности штаммов к антибиотикам проводили диско — диффузным методом. В чашки Петри наливали питательную агаризированную среду МДА (следующего состава: K2HPO4-0,5; MgSO4 – 0,2; NaCl – 0,1; CaCO3 – 0,1; дрожжевой экстракт – 2,0; маннит – 10,0; агар  – 20,0)  4±0,5 мм (что соответствует 25 мл среды на круглую чашку Петри диаметром 90 мм; 31 мл на круглую чашку Петри диаметром 100 мм; 71 мл на круглую чашку Петри диаметром 150 мл). Для получения сплошного газона изучаемых штаммов в подготовленные чашки соблюдая стерильность вносили по 1мл бактериальной суспензии (109 КОЕ/мл) и  равномерно распределяли стерильным шпателем  Дригальского  по всей поверхности питательной среды, оставляли высушиваться в боксе на 5-10 минут, а затем, с помощью пинцета, раскладывали диски пропитанные антибиотиками: рифампицин (5 мкг), стрептомицин (10 мкг), карбенициллин (100 мкг), эритромицин (15 мкг) и тетрациклин (30 мкг). После 3-7 дней инкубации при температуре +27…+28 0С провели учет результатов по диаметру зоны подавления роста штамма: до 10 мм – резистентные (R); от 10 до 15 мм – умеренно-резистентные (I); от 15 до 25 мм – чувствительные (S); свыше 25 мм – высоко — чувствительные (HS).

    Результаты и обсуждение

    Характеристика и происхождение выделенных штаммов

    В 1999-2005 гг. из клубеньков хорошо развитых растений Vigna angularis, выращиваемых на луговой черноземовидной почве Амурской области было выделено в чистую культуру 20 штаммов ризобий без видовой идентификации. В 2012 году на опытном участке лаборатории были посеяны культуры зернобобовых Vigna radiate, Vigna unguiculataи Vigna angularis с целью выделения в чистую культуру из образовавшихся на корнях этих растений новых штаммов ризобий. За 2 срока отбора из клубеньков, образованных на корнях растений было выделено 63 штамма и после многократных пересевов чистых культур на питательные среды МРС с маннитом и лактозой, а так же на МПА по культуральным показателям были отобраны 28 штаммов, обладающих способностью нодулировать сою. Штаммы выделенные из клубеньков Vigna unguiculata обозначили индексом Ву, штаммы, выделенные из клубеньков Vigna radiate обозначили индексом Вр, и штаммы, выделенные из клубеньков Vigna angularis получили индекс ФЗ (таблица 1).

    Новые штаммы ризобий давали рост штриха бактериальной массы различной интенсивности на агаризованной среде МРС с маннитом и лактозой. Осенью 2013 года из института сельского хозяйства (г. Магадан) были получены образцы почвы из под бобовых культур. Весной 2014 года в лабораторных условиях в эту землю были высажены семена сои и вигны. Клубеньки были обнаружены только на вигне (Vigna radiate, Vigna unguiculata). Из этих клубеньков были выделены в чистую культуру 18 штаммов ризобий (индекс Мд), которые давали обильный и хороший рост  штриха бактериальной культуры на агаризованной среде МРС с маннитом (таблица 1).

    В 2014-2016 годах с целью поиска и отбора новых штаммов, наиболее эффективно нодулирующих сою, на опытном участке ВНИИ сои выращивали различные зернобобовые культуры. Наиболее активное и ежегодное образование клубеньков было отмечено у Vigna angularis и различных сортов сои. У люпина, лобии и чечевицы образование клубеньков на корнях не происходило на протяжении трех лет наблюдений. У остальных зернобобовых культур (фасоль, горох, нут, бобы, арахис, вигна Vigna radiate иVigna unguiculata) образование клубеньков было неустойчивым.

    В 2014 году выделение в чистую культуру ризобий проводили из клубеньков вигны (Vigna radiate, Vigna unguiculataи, Vigna angularis), люпина, чины, нута, бобов, гороха арахиса сои и фасоли (таблица 1).

    В 2015 г. из клубеньков вигны (Vigna radiate и Vigna unguiculata) выращенной на луговой черноземовидной почве Амурской области выделено в чистую культуру и оставлено в коллекции 9 штаммов ризобий.

    В августе 2015 года был получен образец почвы из г. Ю-Сахалинска. В контейнер с этой почвой были высажены семена сои и вигны (Vigna radiate иVigna angularis). Клубеньки образовались только на корнях вигны Vigna radiate,  и из них был выделен штамм ризобий и оставлен в коллекции для дальнейшей работы (таблица 1)

    Таким образом, в 2012, 2014,2015 годах из природных популяций Российского Дальнего Востока выделено в чистую культуру 92 штамма ризобий, которые показали различную интенсивность роста на агаризированной среде МРС с маннитом и лактозой. Эти штаммы были проверены по показателям роста на контрольной среде МПА. Большинство штаммов ризобий, выделенных в чистую культуру из почв Амурской, Магаданской и Сахалинской областей оказались вирулентными на сое. Вирулентность выделенных в чистую культуру ризобий проверяли на сое сортов Гармония, МК-100 и Хабаровская-4. Из них в коллекции для дальнейшего изучения было оставлено 76 штаммов.

    Оценка чувствительности выделенных штаммов к антибиотикам.

    Для подтверждения видового статуса выделенных штаммов, предположительно отнесенных к виду B.elkanii,  была проведена оценка устойчивости их к 6 антибиотикам: налидиксовой кислоте, карбенициллину, стрептомицину, эритромицину, рифампицину и тетрациклину (табл.2).

    Из всех 76 изучаемых штаммов – 6 (Ву-4, Вр-22, Ву-34, Ву-35, Ву-37, Ву-38) – были резистентны ко всем 6 антибиотикам, 22 – штамма были резистентны к 5 антибиотикам, 19 штаммов – к 2 антибиотикам, 14 штаммов – к 2 антибиотикам и 3 штамма (Ву-40,ФЗ-31 и ФЗ-23) к 1 антибиотику (рис.1).

    Большинство изучаемых штаммов были резистентны к стрептомицину (97,4%), эритромицину (93,4%), рифампицину (88,2%), а также к налидиксовой кислоте (81,6%). Устойчивость к тетрациклину и карбенициллину показали – 56,5% и 57,9%  соответственно. Штаммы B.elkaniiс индексами Ву-4, Ву-34, Ву-35, Ву-37, Ву-38, Вр-22 были резистентны ко всем 6 исследуемым антибиотикам (рис.2, таблица 3).

    Выводы

    Анализ результатов показал, что большинство исследуемых штаммов B.elkanii имеют множественную лекарственную устойчивость к нескольким антибиотикам (в основном к рифампицину, стрептомицину, эритромицину и налидиксовой кислоте), что соответствует исследованиям Kuykendall et al. и могут быть отнесены к виду Bradyrhizobiumelkanii.

    Об авторах

    Арина Игоревна Сорокина,кандидат ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биологических исследований Федеральный Научный Центр «Всероссийский научно-исследовательский институт сои», 19, ул. Игнатьевское шоссе, Благовещенск, Амурская область 675000, Российская Федерация

    E-mail: aziradot@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-4611-767x

    Мария Владимировна Якименко, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник, заведующая лаборатории биологических исследований, Федеральный Научный Центр «Всероссийский научно-исследовательский институт сои», 19, ул. Игнатьевское шоссе, Благовещенск, Амурская область, 675000, Российская Федерация

    E-mail: mariy-y@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-1141-1900

    Степан Алексеевич Бегун, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биологических исследований Федеральный Научный Центр «Всероссийский научно-исследовательский институт сои», 19, ул Игнатьевское шоссе, Благовещенск, Амурская область, 675000, Российская Федерация

    E-mail: sai@vniisoi.ru https://orcid.org/0000-0002-7989-9068

    УДК 633.853.52:631.847.211:577.11   DOI: 10.32634/0869-8155-2023-366-1-70-75

    Журнал «Аграрная наука»

    Сельское хозяйство, ветеринария, зоотехния, агрономия, агроинженерия, пищевые технологии

    0 Комментарий
    Межтекстовые Отзывы
    Посмотреть все комментарии
      ПОДПИШИТЕСЬ
      БЕСПЛАТНО
      на электронную версию журнала «Аграрная наука» и получайте ежемесячно pdf на свой e-mail.

        Нажимая на кнопку Вы соглашаетесь с политикой обработки персональных данных