Активность каталазы в молоке и ее корреляции с молочной продуктивностью коров в зависимости от срока лактации
Ряд ферментов молока обладают выраженной антиоксидантной активностью. Каталаза — один из наиболее ярких представителей класса оксидоредуктаз (КФ 1.11.1.6), чьим субстратом выступает перекись водорода (H2O2), основными источниками которой в молоке служат реакции окисления гипоксантина и ксантина ксантиноксидазами (КФ 1.1.3.22), реакции, катализируемые сульфгидроксидазой (КФ 1.8.3.2), супероксиддисмутазой (КФ 1.15.1.1), реакции естественного окисления липидов молока, реакции аэробного метаболизма.
Примечательно, что в 1937 году каталаза бычьей печени стала первым кристаллизованным белком в своем классе, на данный момент ее 3D-структура хорошо изучена и подробно описана в ряде работ. Основными источниками каталазы в молоке становятся секреторные клетки молочной железы, лейкоциты и микроорганизмы. В эксперименте с различными режимами температурного воздействия каталаза демонстрирует термостабильность, и это довольно неожиданно для гомотетрамера, стабилизированного нековалентными взаимодействиями, что детально рассмотрено.
Что касается эволюции каталитически активных ферментов в отношении H2O2, она привела к появлению трех семейств металлоферментных генов: типичных гем-каталаз (монофункциональных), гем-каталаза-пероксидаз (бифункциональных) и марганцевых каталаз (негемовых). Монофункциональные гем-каталазы распространены во всех царствах с высокой структурной сохранностью. Наибольшего разнообразия достигли каталазы прокариотических и эукариотических микроорганизмов, которые играют важную роль в патогенезе ряда заболеваний. Положительные по каталазе бактерии (Staphylococcus, Micrococcus, Bacillus и Enterobacteriaceae) могут дольше выживать, с успехом нейтрализуя достаточно эффективную неспецифическую линию защиты в виде H2O2, расщепляя ее до H2O и O2.
Среди симбиотической микрофлоры вымени и молока обнаружены поддерживающие синтез каталазы микроорганизмы. В работе О.Б. Павленко из симбиотической микрофлоры секрета молочных желез здоровых было выделено 52 штамма микроорганизмов (стафилококков, стрептококков, кишечных палочек). Показано, что каталазной активностью (в разной степени) обладают все стафилококки, изолированные от телок, и 72,7% стафилококков молочной железы здоровых коров.
Непрерывный поиск — выделение, характеристика и идентификация новых штаммов бактерий из молока с пробиотическими свойствами демонстрируют следующие результаты в отношении каталаза-позитивных микроорганизмов: «…из выявленных шести изолятов один обладает каталазной активностью» и содержит новый штамм Mammaliicoccus sciuri GMN0, близкородственный Staphylococcus spp.
Важные для пищевой промышленности молочнокислые бактерии, классифицированные как общепризнанные безопасные микроорганизмы, являются каталаза-отрицательными.
Активность каталаз в сыром молоке имеет видовую и породную специфичность и может существенно различаться между отдельными животными. Каталазы психотрофных бактерий молока (микрококков, энтерококков, стафилококков и споровых аэробных палочек) снижают его сыропригодность, их инактивация повышает качество молока и сыров.
Цели данной работы — изучение активности каталазы в молоке здоровых животных с различным уровнем продуктивности и нахождение корреляции между изучаемыми показателями.
В предыдущих работах была установлена активность каталазы в молоке на уровне 0,58–2,54 ед. По данным А.П. Цацулина с соавт., активность каталазы в молоке здоровых животных составляет 7 ед., тогда как у больных маститом она повышается в 10 и более раз. При определении активности каталазы в сыром молоке полярографическим методом активность фермента составляет 195 ед/мл, кроме того, установлены сезонные колебания ее активности.
Отдельно стоит заметить, что ни один из методов определения каталазы в молоке не является «золотым стандартом» для лабораторий по всему миру. Поэтому при изучении данного фермента большое значение имеет не только способ определения активности, но и условия эксперимента, продолжительность наблюдений.
Материалы и методы исследования
Отбор образцов производили у здоровых коров второй лактации черно-пестрой породы из ФГБУ ПЗ «Ладожский» (Краснодарский край, Россия) в 2022–2023 гг. Содержание привязное с выгулами в летнем лагере. В общей сложности ежемесячно в случайную выборку для исследования отбирали 25% дойного стада. При этом учитывали физиологическое состояние, в том числе данные о количестве лактаций, дате отела, информацию о суточном удое и числе дойных дней.
Во время контрольных доек отбирали среднюю пробу молока согласно ГОСТ 26809.1. Анализ полученных проб производили на протяжении года в лабораториях Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный исследовательский центр животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста».
После предварительной оценки и обработки первичных данных часть результатов исключили из выборки и анализа, и общее число животных, вошедших в группы, составило 280 голов.
Чтобы иметь возможность наблюдать исследуемых животных в условиях одного сезона (исключить влияние температуры, влажности, качества корма), было принято решение сформировать 6 групп параллельно:
- 11–30 дней лактации,
- 31–60 дней лактации,
- 61–90 дней лактации,
- 91–120 дней лактации,
- 121–180 дней лактации,
- 181–300 дней лактации.
Анализировали удой по результатам контрольных доек, биохимические показатели молока коровьего определяли на приборе CombiFoss 7 (Дания) (жир, белок истинный, белок общий, лактозу, сухой обезжиренный молочный остаток (СОМО), сухое вещество (СВ), анализ суммарного количества водорастворимых антиоксидантов (СКВА) на приборе «ЦветЯуза 01-АА» (НПО «Химавтоматика», Россия). Определение каталазы подробно описано в материалах публикации А.А. Савиной с соавт.
Статистическую обработку полученных результатов проводили в программе Microsoft Exсel (США). При помощи пакета «Анализ данных» рассчитаны данные описательной статистики, выполнен расчет корреляций, включая корреляции между каталазой и СКВА в зависимости от дней лактации. Достоверность различий между группами проверяли с помощью U-теста Манна — Уитни.
Результаты и обсуждение
В результате исследования установлено, что количество водорастворимых антиоксидантов и активность каталазы в молоке коров зависели от сроков лактации. В раннем молоке первого месяца раздоя содержится наибольшее количество водорастворимых антиоксидантов. Пики активности каталазы установлены в начале и конце лактации. Это можно объяснить физиологическими изменениями, связанными с серьезными метаболическими переходами периода раздоя и близостью периода запуска (табл. 1).
В результате исследования установлено, что для первых 11–30 дней лактации (группа 1-я) установлена максимальная активность СКВА 17,2 мг/мл, далее показатель снижается на 19,2% (3,3 мг/мл), 37,8% (6,5 мг/мл), 16,3% (2,8 мг/мл, р < 0,05), 36,0% (6,2 мг/мл), 25,6% (4,4 мг/мл) в каждой следующей группе по отношению к 1-й соответственно (табл. 1). Максимальная активность каталазы установлена для 1-й и 6-й групп (табл. 1).
В группах 2–5-я происходит снижение активности каталазы на 50,8% (2,8 отн. ед.), 66,7% (3,7 отн. ед.), 56,8% (3,12 отн. ед.), 55,3% (3,03 отн. ед.) по отношению к 1-й группе соответственно (табл. 1). В 6-й группе активность каталазы повышается относительно 1-й на 6,8% (0,4 отн. ед.). Повышение активности каталазы на последнем этапе лактации, вероятно, объясняется тем, что начинается разрушение секреторных клеток молочной железы, вместе с чем происходит повышенный выход фермента в молоко.
Таким образом, наблюдаемые зависимости изменения антиоксидантных параметров от сроков лактации (то есть от выделенных авторами периодов лактации в течение года) не являются линейными. Поэтому были рассчитаны корреляционные взаимосвязи антиоксидантных параметров с биохимическим составом и физиологическими показателями.
Однако перед анализом корреляционных связей необходимо охарактеризовать и динамику изменения удоев коров, и биохимических показателей молока в ходе лактации, чтобы с помощью этих данных составить представление о выявленных корреляциях (рис. 1)
Так, с увеличением дней лактации наблюдается уменьшение в удое. Значения белка и жира имеют наивысшие значения в период до 60-го дня лактации, затем снижаются и вновь увеличиваются со 120-го дня лактации, а вот уровень лактозы, наоборот, показывает наивысшие значения к середине лактации.
Динамика изменения показателя СОМО наиболее совпадает с изменениями белка, поскольку этот показатель определяется после удаления всех жиров из образца (с остающимися белками). Показатель СВ изменяется пропорционально вслед за изменениями в количестве как белка, так и жира, поскольку он напрямую связан с этими показателями.
Расчет корреляционных коэффициентов (r) был выполнен для каждой группы. Корреляции между показателями антиоксидантной активности молока и данными контрольных доек представлены в таблице 2.
Можно отметить, что для каталазы наблюдается отрицательная корреляционная взаимосвязь разной силы с днями лактации и утренним удоем (кроме 1-й группы). Между СКВА и каталазой наблюдается отрицательная корреляция в 1–4-й группах, для животных, лактирующих более 120 дней, корреляции положительные и даже сильные на спаде лактации для 6-й группы — 0,91 (табл. 2). Авторы считают, что показатели активности каталазы не только являются некоторой частью СКВА, но и зависят от содержания других компонентов молока. Поэтому все корреляции, даже достаточно умеренные, между ними являются значимыми и в дальнейшем будут проанализированы в совокупности с дополнительными зоотехническими показателями коров, которые пока не удалось получить от хозяйства для всех животных в эксперименте.
Если проанализировать изменение корреляций между каталазой и СКВА в зависимости от дней лактации, то видна линейная зависимость (в отрицательной области от 23-го до 105-го дня с переходом в положительную область от 110-го до 226-го дня). Корреляции между показателями антиоксидантной активности молока и данными биохимического анализа представлены в таблице 3.
В период раздоя и спада лактации (1-я и 6-я группы) отмечались наивысшие коэффициенты корреляции между каталазой и жиром — 0,51 и 0,57 соответственно (табл. 3).
Для всех сроков лактации прослеживается отрицательная корреляция каталазы как с истинным белком, так и с общим (табл. 3). Наибольшие коэффициенты корреляции наблюдаются для 1-й (-0,53), 3-й и 4-й (-0,36 и -0,39), а также для 6-й (-0,37) групп. С увеличением количества общего белка активность каталазы не повышается, что может быть связано с отсутствием взаимосвязи синтеза индивидуального белка каталазы относительно увеличения значений общего белка. По-видимому, в организме вырабатывается определенное количество каталазы, которое не зависит от изменений общего белка. При этом в ряде групп нет корреляции между общим белком и СКВА, а если есть, то она является умеренной или даже сильной (1-я и 2-я группы). Разница в коэффициентах корреляции между СКВА с общим и истинным белком, вероятно, связана с небелковым составом азотсодержащих соединений. Отличия в значениях являются минимальными и близкими по направлению.
Для лактозы, СОМО и СВ разброс значений достаточно вариабелен. Высокий коэффициент корреляции между СКВА и лактозой может объясняться ее наивысшим значением в период раздоя, особенно в первый месяц. Так, например, разница между содержанием лактозы меняется на 2% относительно предыдущей группы. На поздней стадии лактации происходит изменение проницаемости эпителия молочной железы, что снижает синтез лактозы и, следовательно, секрецию молока или удой коровы.
Известно, что в указанных условиях лактоза окисляется до лактобионовой кислоты и изомеризуется до лактулозы на монометаллических электродах, что объясняет ее вклад в показатель СКВА. Кроме того, возможны окисление С2 спиртовой группы и образование 2-кето-лактобионовой кислоты. Все указанные эффекты приводят к тому, что наблюдаемые зависимости изменения антиоксидантных параметров от сроков лактации не являются линейными.
Выводы
Количество каталазы изменяется от числа лактационных дней, но прямой зависимости не установлено, наивысшие значения активности фермента наблюдались в первый месяц и на спаде лактации. В большинстве случаев наблюдаются отрицательные корреляции между каталазой и числом лактационных дней, в промежутке 90–120 дней можно говорить об их отсутствии.
Однако если рассматривать не абсолютные величины, а изменение коэффициентов корреляций между каталазой и СКВА с увеличением дней лактации, то наблюдается линейная зависимость (как в отрицательной, так и в положительной области). Чем больше в молоке сухого обезжиренного молочного остатка, тем меньше активность каталазы. Это обычно связано с пониженными показателями жира, а следовательно, меньшим количеством жировых шариков, к которым прикрепляется каталаза.
Соответственно, отмечается сильная связь активности каталазы и показателей жира для ряда групп. В целом наблюдаемые зависимости изменения антиоксидантных параметров от сроков лактации являются нелинейными и требуют постоянного контроля для оценки возможности более длительного хранения сырого молока без потери его качества.
Об авторах
Анастасия Анатольевна Савина; научный сотрудник отдела физиологии и биохимии сельскохозяйственных животных
kirablackfire@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-0257-1643
Оксана Александровна Воронина; старший научный сотрудник отдела физиологии и биохимии сельскохозяйственных животных, кандидат биологических наук
voroninaok-senia@inbox.ru; https://orcid.org/0000-0002-6774-4288
Сергей Юрьевич Зайцев; ведущий научный сотрудник отдела физиологии и биохимии сельскохозяйственных животных доктор биологических наук, доктор химических наук, профессор
s.y.zaitsev@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-1533-8680
Федеральный исследовательский центр животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, пос. Дубровицы, 60, г. о. Подольск, Московская обл., 142132, Россия
УДК 636.2.034/637.047
DOI: 10.32634/0869-8155-2024-385-8-118-123
Сельское хозяйство, ветеринария, зоотехния, агрономия, агроинженерия, пищевые технологии
