Анализ иммунодоминантных пептидов вируса африканской чумы свиней для конструирования кандидатных вакцин
Вирус африканской чумы свиней (АЧС) — сложный оболочечный дезоксивирус семейства Asfarviridae, поражающий домашних и диких свиней и переносимый клещами-мягкотелками рода Ornithodoros. Вирусный геном представлен двухцепочечной ДНК размером от 170 до 195 т. п. н. и кодирует более 150 полипептидов с молекулярными массами от 10 до 150 кДа, не менее 50 из которых являются компонентами вириона. По своим функциональным характеристикам они подразделяются на несколько основных групп: белки прикрепления и проникновения; белки вирусного морфогенеза; белки тропизма и вирулентности; регуляторные белки.
Вирус АЧС при диаметре вирусных частиц, достигающем 260–300 нм, имеет многослойную структуру, включающую наружную оболочку, капсид, внутреннюю оболочку, сердцевинную оболочку и нуклеоид. Внешняя оболочка, как правило, формируется из клеточной мембраны хозяина в процессе отпочковывания вируса и характеризуется наличием белков: CD2v — основного маркера вневирусной структуры и p12, обеспечивающего адсорбцию вирионов путем связывания со специфическими рецепторами клеточной мембраны хозяина. Вирусный капсид диаметром около 250 нм состоит из белков p72, образующего псевдогексамерные капсомеры, pB438L, необходимого для формирования вершин капсида, pE120R, ответственного за транспорт вируса от места сборки к цитоплазматической мембране, а также минорных капсидных белков M1249L, p17, p49, H240R. В формировании третьего слоя — двухслойной липидной внутренней оболочки — задействованы p17 и p54, участвующие в сборке капсидного слоя, pE248R, pE199L, являющиеся частью механизма вирусной интеграции, и белок прикрепления р12, который ранее считался находящимся на внешней мембране. Сердцевинная оболочка состоит из предшественников полипротеинов pp220 (p150, p37, p34, p14, p5), pp62 (p35, p15, p8) и цистеиновой протеазы pS273R. Нуклеоид ASFV диаметром 70–100 нм представляет собой электроплотную структуру, включающую вирусный геном и связанные с ним белки, такие как структурный протеин p10, pA104R, и части транскрипционного аппарата. Помимо структурных белков, геном ASFV кодирует ряд ферментов, участвующих в транскрипции генов: мультисубъединичные ДНК-полимеразы, полиаденилат-полимеразы, блокирующие ферменты и факторы ранней транскрипции.
Большинство белков ASFV обладают ограниченным количеством экспериментально доказанных функций, а функциональная геномика вируса базируется преимущественно на прогнозах на основе консервативных аминокислотных последовательностей. Определение роли белков вируса АЧС в развитии инфекционного процесса имеет решающее значение для раскрытия патогенеза АЧС, а также механизмов, обеспечивающих способность вируса к уклонению от обнаружения иммунной системой организма-хозяина.
При выборе иммуногенных пептидов для конструирования кандидатных вакцин прежде всего необходимо определить потенциальные мишени иммунных реакций, что достигается посредством анализа геномных и кодируемых ими аминокислотных последовательностей. В связи с этим цели настоящего исследования — поиск и биоинформатический анализ иммунодоминатных пептидов ASFV для конструирования кандидатной вакцины против АЧС.
Материал и методы исследования
Анализ 31 кандидатной протеиновой последовательности более 100 штаммов и эпизоотических изолятов ASFV, полученных из депозитария Национального центра биотехнологической информации (NCBI, США), проводили с использованием методов in silico прогнозирования по базе данных иммуногенных эпитопов The Immune Epitope Database (IEDB) (NIH, США). Анализ был произведен относительно следующих протеинов: B169L, C257L, I329L, pI243L (TFIIS), A151R, B602L, H339R, p14.5, p72, p54, p30, pp62, MGF 100-2L, MGF 110-1L, MGF110-4L, MGF 110-6L, MGF 300-1L, MGF 300-4L, MGF 360-1L, MGF 360-2L, M1249L, p17, p49, p12, p22, p54, pE248R, I226R, EP153R, H240R, pp220. Поиск трансмембранных доменов и сигнальных пептидовосуществляли при помощи онлайн-ресурсов ТМНММ 2.0 и SignalP 5.0 (DTU Health Tech, Дания). Прогнозирование сайтов N- и О-гликозилирования осуществляли при помощи сервисов NetNGlyc 1.0 и DictyOGlyc 1.1 (DTU Health Tech, Дания) при установленных стандартных параметрах.
Физико-химические свойства протеинов определяли при помощи онлайн-ресурса Peptide Property Calculator — www.pepcalc.com (Innovagen AB, Швеция).
Результаты и обсуждение
Известно, что антигенные эпитопы, способные к индукции Т- и В-клеточного иммунитета, позиционируются как перспективные кандидаты для конструирования вакцин и диагностических тестов. Ключевым этапом конструирования вакцин является прогнозирование иммуногенных эпитопов.
На основании первичного анализа 31 аминокислотной последовательности было установлено, что наиболее перспективными в иммуногенном отношении являются MGF100-2L, внутримембранный гликопротеин p54, фосфопротеин p30, основной белок капсида p72, полипротеин pp220, полипротеин pp62, гликопротеин CD2v, цистеиновая протеаза S273R. Количество иммуногенных эпитопов и тип выявленного иммунного ответа для каждого протеина представлены в таблице 1.
Исходя из результатов данного анализа (количество иммуногенных эпитопов, тип и выраженность иммунного ответа, наличие иммунного ответа у целевых животных), максимальным иммуногенным потенциалом обладают протеины p54, p30, p72, pp62, pp220.
Гликопротеин p54 представляет собой трансмембранный белок I типа, образующий гомодимеры с дисульфидной связью и играющий ключевую роль во внутриклеточном транспорте вируса. Этот белок также принимает участие в ранних стадиях развития вирусной инфекции и отвечает за присоединение ASFV к клетке хозяина и наряду с другими иммуногенными белками является хорошей мишенью в серологической диагностике АЧС. В ходе анализа в структуре гликопротеина были выявлены 15 иммуногенных участков с преимущественно B-клеточным типом иммунного ответа, явно выраженный трансмембранный домен и 3 сайта О-гликозилирования в позициях 23, 25 и 84 аминокислоты. Сайтов N-гликозилирования и сигнальных пептидов не обнаружено.
Фосфопротеин p30 обладает наиболее высокой экспрессией на ранней стадии инфекции и является одним из наиболее антигенных белков ASFV, индуцирующих образование вируснейтрализующих антител у инфицированных свиней. Несмотря на то, что ранние исследования продемонстрировали роль p30 в интернализации вируса в клетку-хозяина, его регуляторная функция в процессах инфицирования остается в значительной степени неизвестной. В структуре p30 было выявлено 20 иммуногенных участков с преимущественно B-клеточным типом иммунного ответа; протеин является высокоиммуногенным. Трансмембранные домены и сигнальные пептиды не выражены, определен один сайт N-гликозилирования.
Полипротеин pp220 представляет собой N-миристоилированный полипептид, который в ходе протеолитического процессинга образует белки р150, р37, р34 и р14, присутствующие внутри зрелого вириона в эквимолярном количестве и составляющие до четверти его общей белковой массы. Мажорные белки p35 и p15 также являются продуктами процессинга предшественника pp62 и участвуют в морфогенезе основных компонентов вириона. Оба полипротеина экспрессируются на поздних стадиях инфекции и подвергаются посттрансляционному процессингу вирусной цистеиновой протеиназой pS273R. В структуре pp220 были определены 23 сайта N-гликозилирования; 20 иммуногенных участков с преимущественно B-клеточным типом иммунного ответа; трансмембранных доменов и сигнальных пептидов не выявлено.
Капсидный белок p72. Икосаэдрический капсид ASFV состоит из 8280 копий p72, кодируемого геном B646L, на долю которого приходится около 32% от общей массы вирусных частиц, что делает его основным антигеном, обнаруживаемым у инфицированных свиней. Более того, благодаря своей иммуногенности и антигенной стабильности p72 используется в рутинной серологической диагностике АЧС. Отдельные исследования показали, что для образования икосаэдрического вирусного капсида необходим также белок B602L, описанный как молекулярный шаперон для правильной укладки p72. В структуре p72 было выявлено 12 иммуногенных эпитопов с преимущественно B-клеточным типом иммунного ответа, а также 7 сайтов N-гликозилирования. Выраженные трансмембранные домены и сигнальные пептиды отсутствуют.
Полипротеин pp62. Роль полипротеина pp62 в построении коровой оболочки вируса малоизучена, однако предполагается, что совместно с миристоилированным pp220 он формирует сердцевинную оболочку вириона, связанную с липидной мембраной. В структуре pp62 было обнаружено три эпитопа с Т-клеточным типом иммунного ответа. Определены шесть сайтов N-гликозилирования; трансмембранные домены и сигнальные пептиды отсутствуют.
Таким образом, структура всех представленных белков обладает потенциалом для формирования иммунного ответа. Кроме того, имеются данные о формировании одного случая Т-клеточного иммунного ответа к MGF 100-2L, а также слабо выраженного В-клеточного иммунного ответа к последовательностям CD2v и цистеиновой протеазы S273R. Карты аминокислотных последовательностей анализируемых протеинов с указанием локализации Т- и B-клеточных эпитопов, сигнальных пептидов, сайтов N- и О-гликозилирования и трансмембранных доменов представлены в таблице 2.
Как видно из таблицы, аминокислотные последовательности p54, p30, pp220, pp62, pS273R представлены экзогенной структурой без внутренней части молекулы, трансмембранных доменов и сигнальных пептидов, что подразумевает возможность формирования иммунного ответа: многие исследователи отмечают, что мембранная топология белков коррелирует с их иммуногенностью. Последовательности MGF 100-2L, p54, p72 и CD2v характеризуются наличием, кроме экзогенной последовательности, трансмембранного домена, и (в случае последовательностей p54 и CD2v) наличием внутренней части белковой молекулы. В последовательности CD2v, помимо этого, идентифицирован и сигнальный пептид. Сообщается, что присутствие лидерного пептида может способствовать повышению стабильности и растворимости целевого белка при гетерологичной экспрессии, а также уровней его внеклеточной секреции. Кроме того, в недавних исследованиях было показано, что сигнальный пептид способен стимулировать клеточный ответ и может быть использован как самостоятельный вакцинный кандидат.
На следующем этапе исследования для прогнозирования безопасности и эффективности применения белков в качестве компонентов вакцин была проведена оценка их физико-химических свойств. Известно, что конформация синтезируемого рекомбинантного белка может отличаться от той, которую он имеет в клетке, что может приводить к изменению его свойств и влиять на эффективность конъюгации с адъювантами. Нами были рассчитаны физико-химические параметры отобранных протеинов, влияющие на их стабильность и растворимость при экспрессии in vitro и применении in vivo: молекулярная масса, коэффициент экстинкции, суммарный заряд при нейтральном рН, изоэлектрическая точка pI и степень растворимости в воде. Обобщенная пептидная калькуляция анализируемых аминокислотных последовательностей представлена в таблице 3.
Вакцинный потенциал некоторых исследуемых белков был частично изучен ранее. Так, в ряде работ были идентифицированы белки, отвечающие за способность к интернализации вируса: p72, p54 и p30. Показано, что антитела к белкам p72 и p54 могут ингибировать связывание вируса с клетками, а антитела к p30 — непосредственно интернализацию вируса.
Были идентифицированы и другие белки вируса АЧС, которые также отвечают за проникновение и распространение вируса, в частности EP402R, p12, D117L. Применение данных белков в качестве протективных антигенов обеспечивало только частичную защиту, однако не защищало животных от вирусов АЧС гетерологичного происхождения. Исходя из локализации, структуры и функций белков, проявляемых в оболочке вирионов и цитоплазме инфицированных клеток, а также последствий иммунизации свиней рекомбинантными белками либо ДНК-конструкциями, в качестве потенциально иммуногенных рассматривались также различные комбинации белков p72, p54, p30, CD2v. Экспериментально и теоретически обоснованной является гипотеза о том, что формирование вирусоспецифической защиты при АЧС должно базироваться на нескольких белках, каждый из которых способен индуцировать гуморальные либо клеточные эффекторы иммунитета. Для того чтобы избежать нежелательной индукции антител и усилить специфические ответы, целесообразным представляется создание генетических конструкций, кодирующих несколько антигенных детерминант, что, в свою очередь, подразумевает поиск новых мишеней, которые будут использоваться в исследованиях по разработке вакцин.
Выводы
Применение биоинформатических подходов позволило отобрать потенциально иммуногенные протеины вируса АЧС, которые в перспективе будут использованы для конструирования новых кандидатных векторных вакцин. Учитывая количество антигенных детерминант, наибольший потенциал для применения в качестве вакцинного антигена, на наш взгляд, имеют протеины p54, p30, p72, pp62, однако реальные данные об их иммуногенности будут установлены при практическом испытании рекомбинантных антигенов.
Об авторах
Марина Анатольевна Ефимова, доктор биологических наук, профессор, Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана, ул. Сибирский тракт, 35, Казань, 420029, Российская Федерация;
· Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности — Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт, Научный городок — 2, Казань, 420075, Российская Федерация;
· Казанский (Приволжский) Федеральный университет, ул. Кремлевская, 18, Казань, 420008, Российская Федерация
marina-2004r@mail.ru
https://orcid.org/0000-0001-8786-1310
Антонина Глебовна Галеева, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник,
· Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана, ул. Сибирский тракт, 35, Казань, 420029, Российская Федерация;
· Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности — Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт, Научный городок — 2, Казань, 420075, Российская Федерация;
· Казанский (Приволжский) Федеральный университет, ул. Кремлевская, 18, Казань, 420008, Российская Федерация
antonina-95@yandex.ru
https://orcid.org/0000-0003-2650-6459
Алина Ильфатовна Хамидуллина, студент, Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана, ул. Сибирский тракт, 35, Казань, 420029, Российская Федерация
https://orcid.org/0000-0001-5593-2399
Рустам Хаметович Равилов, доктор ветеринарных наук, профессор, Казанский (Приволжский) Федеральный университет, ул. Кремлевская, 18, Казань, 420008, Российская Федерация
https://orcid.org/0000-0001-7210-7470
УДК 619:616.988.27:636.4 DOI: 10.32634/0869-8155-2023- 368-3-40-45
Сельское хозяйство, ветеринария, зоотехния, агрономия, агроинженерия, пищевые технологии
