Выявление однонуклеотидных полиморфизмов в гене BMP-2 и их ассоциаций с продуктивными признаками радужной форели
Радужная форель — один из наиболее распространенных видов рыб, используемых в аквакультуре в России и многих других стран. Аквакультура вносит значительный вклад в продовольственную и экономическую безопасность страны, а также является предметом многочисленных генетических исследований. Этот объект крайне интересен для изучения вследствие особенностей организации генома (триплоидность и тетраполидность, определение пола в раннем развитии, дублированность ряда генов). Учитывая большое экономическое значение радужной форели и генетическую пластичность вида, эта рыба привлекла внимание не только генетиков, но и селекционеров.
Созданы породы радужной форели, которые отличаются высокими продуктивными качествами и приспособленностью к выращиванию в условиях аквакультуры с использованием коммерческих кормов. В частности, интерес представляет новое селекционное достижение — ропшинская золотая форель, которая имеет характерную золотистую окраску чешуи.
Данные по полному геному радужной форели сейчас доступны исследователям в базе данных NCBI. Важным геном, влияющим на рост и развитие форели, является морфогенетический ген BMP-2, продукт которого — транскрипционный фактор для ряда других генов.
По литературным данным, этот ген проявляет выраженную экспрессию в мышечной ткани не только у радужной форели, но и у рыб семейства карповых. Млекопитающие имеют только одну копию гена — BMP-2, в то время как у костистых рыб он дублирован, то есть представлен в двух копиях на разных хромосомах. Функциональное значение гена и его аллельные варианты в связи с формированием продуктивных признаков наиболее подробно изучались у овец, коз и птиц.
Белок, кодируемый геном, является индуктором пролиферации клеток ряда тканей и органов в процессе онтогенеза у рыб. Несмотря на большой интерес к изучению этого участка генома рыб, многие вопросы остаются открытыми, в частности как однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) связаны с ростом и развитием особей.
Цель работы – обнаружить SNP и связать их наличие с продуктивными признаками у рыб в разные периоды роста и развития.
В рамках решения поставленной цели сформулированы следующие задачи:
1. Создать опытные группы радужной форели на базе ФСГЦР «Ропша», собрать фенотипические данные и биологический материал от самок и самцов.
2. Провести in silico дизайн праймеров для выбранного дублированного гена (Bmp-2), амплифицировать участки гена методом полимеразной цепной реакции.
3. Секвенировать выбранные участки гена и выявить связи генотипов с признаками.
Материалы и методы исследования
Биологический материал в виде образцов крови из хвостовой вены форели собирали на базе Федерального селекционно-генетического центра рыбоводства (ФСГЦР), расположенного в Ленинградской области, в 2020–2022 годах.
Объект исследования — популяция радужной форели породы ропшинская золотая.
Для учета роста и развития потомства икру от 20 пар производителей закладывали на инкубацию согласно биотехнике выращивания радужной форели ФСГЦР. В соответствии с технологической схемой разведения рыбы самки отбирались в возрасте 4 лет, а самцы — 2.
Самки и самцы скрещивались попарно с дальнейшей индивидуальной закладкой икры на инкубацию. Промеры потомков (длина тела по Смиту, длина до конца чешуйчатого покрова, длина головы, высота тела, толщина тела) учитывали ежемесячно на протяжении 6 месяцев.
Молекулярно-генетическая часть работы была проведена в 2021–2022 годах в лаборатории молекулярной генетики Всероссийского научно-исследовательского института генетики и разведения сельскохозяйственных животных — филиале ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста» (ВНИИГРЖ) (г. Санкт-Петербург — Пушкин).
Учет показателей для каждой семьи проводили с помощью мерной доски. Учитывали такие продуктивные признаки, как масса, длина тела по Смиту, длина до конца чешуйчатого покрова, длина головы, высота и толщина тела, вес икры, количество икры в 5 г, объем эякулята, подвижность спермы (сек/%).
Далее икра была заложена в инкубационные аппараты ИЛ-4 («Агромаш Интер», Россия). В процессе инкубации погибшая икра выбраковывалась. В анализ включили данные бонитировки потомства от использованных пар производителей.
Выделение геномной ДНК у самок и самцов проводилось фенольно-детергентным методом с последующим осаждением ДНК этанолом.
Проведение ПЦР и секвенирования
Дизайн ПЦР-праймеров, специфичных для двух интронных участков гена BMP-2 и одного экзона (хромосома 4), проводили по онлайн-программе Primer 3 Plus (Untergasser, Germany) (табл. 1).
Последовательности нуклеотидов указанных генов были найдены в литературе и взяты из доступной базы данных NCBI.
Амплификацию методом ПЦР проводили на амплификаторе Thermal Cycler T100 (Bio-Rad, США) в следующем режиме: 95 °С — 4 мин., 40 циклов 95 °С — 20 сек., 60 °С — 20 сек., 72 °С — 20 сек., финальная элонгация 72 °С — 4 минуты. ПЦР-продукт проверяли на электрофорезе в 2,0%-ном агарозном геле в буфере 0,5 x TBE.
Секвенирование по Сэнгеру полученного амплификата осуществляли с помощью генетического анализатора Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer (Thermo Fisher, USA) с использованием коммерческих наборов BigDye® Terminator v3.1 Sequencing Standard Kit (Thermo Fisher, USA) с теми же праймерами, с которыми проводилась амплификация согласно протоколу производителя.
Для выравнивания нуклеотидных последовательностей использовался программный пакет MEGA 6.06 (https://www. megasoftware.net, Tamura, Japan). Биометрическая обработка данных выполнена с помощью пакета Excel и Statistica 10 (США).
Выявление связей между генотипами и продуктивными признаками рыбы проводили путем вычисления достоверности разности между средними значениями количественного признака в выборках особей разного генотипа (типа AA, AB, BB). Расчет основывался на критерии достоверности td по Стьюденту в соответствии с общепринятыми методиками статистического анализа (при p < 0,05).
Результаты и обсуждение
При учете размерно-весовых показателей наблюдалась выраженная изменчивость по признакам, что является характерной особенностью как для взрослых производителей, так и для их растущего потомства.
Секвенирование участков гена BMP-2, локализованного на хромосоме 4, выявило ряд нуклеотидных замен самок и самцов (табл. 2, 3). В частности, в экзоне 1 выявлены SNP в позициях A70824367G и C70824570T, в интроне 1 — A70824829G, G70824841T и G70826709A. Частоты встречаемости генотипов существенно отличались у самок и самцов. Например, полиморфизм в позиции G70824841T у самок отмечался с частотой 0,5 (8 особей из 16) по генотипу GG (табл. 2), а у самцов генотип GG не встречался вовсе (табл. 3).
Выявленные SNP в участках гена BMP-2 и бонитировочная информация о размерно-весовых и других признаках потомства генотипированных производителей позволили провести анализ ассоциаций (табл. 4). В позиции А70824829G гена BMP-2-1IN выявлена статистически значимая ассоциация между показателем «длина головы» и генотипами АА/АG, р < 0,05 у самок золотой форели. Генотип АG превосходит генотип АА по этому показателю (табл. 4).
Несмотря на то что средние показатели массы рыбы у носителей генотипа AG были выше, чем у представителей с генотипом AA (3498 vs 3111), статистической значимости различия не достигли вследствие высоких значений ошибок средних. Учитывая, что интронные участки генов не кодируют аминокислотную последовательность в белках, но могут иметь регулирующую активность, последняя, вероятно, определяет функциональное значение замен одного нуклеотида в интроне гена BMP-2-1IN в позиции А70824829G как у самок, так и у самцов.
У самцов золотой форели также выявлена ассоциация замены (генотипы GT/TT) в позиции G70824841Т интрона гена BMP-2_1IN с показателем «объем эякулята» р < 0,01. Особи с генотипом GT превосходили по этому показателю рыб с генотипом ТТ (5,07 и 3,43 мл соответственно). По другим признакам, таким как масса рыбы, длина тела по Смиту и подвижность сперматозоидов, статистически значимых ассоциаций выявлено не было (табл. 5). Эти данные указывают на то, что интронные участки гена BMP-2 участвуют в регуляции экспрессии других генов, вовлеченных в спермопродукцию у рыб.
Ранее уже были опубликованы данные о том, что некодирующие участки ДНК, к которым относят и интроны, могут иметь регулирующую функцию у рыб, других животных и человека.
Выводы
Таким образом, подбор производителей форели по цвету чешуи и хозяйственно ценным признакам (масса тела, длина тела по Смиту, масса икры, объем эякулята и др.) и выращивание рыб новой селекционной формы — ропшинская золотая форель — позволили провести учет фенотипических признаков для дальнейшей работы.
Используя базу данных NCBI, впервые были подобраны праймеры in silico для амплификации изучаемых участков одного экзона и двух интронов гена BMP-2 в геноме радужной форели. Анализ данных секвенирования этих участков на предмет наличия SNP приводит к выявлению статистически значимых ассоциаций между полиморфизмами и продуктивными признаками, такими как длина головы у самок и объем эякулята у самцов.
Данные результаты о связи однонуклеотидных полиморфизмов в позициях А70824829G и G70824841Т с продуктивными признаками, такими как длина головы у самок и объем эякулята у самцов, можно использовать при подборе пар производителей, несущих эти аллели, с целью получения потомства с этими желательными признаками в коммерческих целях.
Об авторах
Валентина Ивановна Тыщенко; кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
tinatvi@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-4964-9938
Юрий Сергеевич Щербаков; кандидат биологических наук, младший научный сотрудник
yura.10.08.94.94@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-6434-6287
Ольга Анатольевна Николаева; младший научный сотрудник
trantoburito@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-3828-1111
Валерий Павлович Терлецкий; доктор биологических наук, профессор лаборатории
valeriter@mail.ru; https://orcid.org0000-0003-4043-3823
Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных — филиал Федерального исследовательского центра животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, Московское шоссе, 55А, Пушкин, Санкт-Петербург, 196601, Россия
УДК 639.3.05
DOI: 10.32634/0869-8155-2024-385-8-145-149
Сельское хозяйство, ветеринария, зоотехния, агрономия, агроинженерия, пищевые технологии
