Влияние различных методов сушки на некоторые физико-химические свойства и антиоксидантную активность гидролизата белков куриного эмбриона
В настоящее время в мировой науке и технологии интенсивно проводят работы, связанные с эффективной переработкой сырья животного происхождения, в том числе в интересах медицины. Особое внимание обращается на белки куриного яйца в качестве источника пептидов для пищевой и фармацевтической промышленности.
Пептиды — это органические вещества, образованные короткими цепочками 2-50 аминокислотных остатков, соединенных между собой пептидными связями. Некоторые пептиды выполняют важные функции в организме человека, включая регуляцию биологических процессов, участие в процессах иммунитета и проявление других биологических активностей, например антимикробной и антиоксидантной.
Учитывая количество различных аминокислот, их возможные варианты соединения в цепочки, а также вероятность химической модификации, существуют возможности получения молекул пептидов, обладающих как отдельными полезными активностями, так и комплексом активностей.
Недавние исследования показали, что белки и пептиды, полученные из куриных яиц, обладают различными типами антиоксидантной, противовоспалительной, иммуномодулирующей, антимикробной, противодиабетической, противораковой активностью, гипотензивным эффектом, хелатирующей и пенообразующей способностью.
Ранее авторами было подтверждено, что наличие большого комплекса белков внеэмбриональных и эмбриональных тканей птиц дает возможность получать широкий перечень пептидов, обладающих различными биологическими активностями. Проведенные исследования свидетельствуют о значительном увеличении биологической активности компонентов куриного яйца в процессе инкубации. Выявлено изменение качественного состава белков в различных компонентах куриного яйца, обусловленное в основном формированием новых органов и тканей в процессе эмбриогенеза. Моделирование желудочно-кишечного пищеварения in vitro привело к значительному увеличению антиоксидантной, противовоспалительной и гипотензивной активности.
Однако пептиды, кроме положительных качеств, обладают и некоторыми недостатками, в частности низким уровнем стабильности как в растворах, так и в биологических жидкостях организма. Поэтому, кроме создания технологии получения пептидсодержащих субстанций, требуется разработка приемов стабилизации данных комплексов как в процессе хранения, так и при применении.
Ранее для повышения стабильности и биологической активности пептидов авторами были предприняты попытки создания комплексов бета-циклодекстрина (βЦД) и гидролизатов белков куриного эмбриона. Бета-циклодекстрин — это циклический олигосахарид, состоящий из семи остатков глюкозы. Он широко используется в различных отраслях промышленности, включая фармацевтику, пищевую, косметическую и химическую.
В фармацевтике βЦД применяется для улучшения растворимости и биодоступности лекарственных препаратов, особенно плохо растворимых в воде. В пищевой промышленности он используется как пищевая добавка (E459), стабилизатор и эмульгатор. В косметике βЦД применяется для стабилизации активных компонентов, маскировки запахов и улучшения текстуры. Кроме того, βЦД значительно улучшает процесс порошкообразования различных субстанций.
Основная задача данного исследования — сравнить способы получения стабилизированных порошков комплексов бета-циклодекстрина и смешанного гидролизата белков куриного эмбриона методами лиофильного и распылительного высушивания.
Материалы и методы исследования
Исследование проводили на базе межкафедральной научно-образовательной лаборатории экспериментальной иммуноморфологии, иммунопатологии и иммунобиотехнологии медико-биологического факультета Северо-Кавказского федерального университета в 2025 году (г. Ставрополь, Россия).
Использовали оплодотворенные куриные яйца Хайсекс Браун, приобретенные в ООО «Агрокормсервис плюс» (станица Гиагинская, Республика Адыгея, Россия).
Инкубировались яйца в инкубаторе Rcom Maru Deluxe Max 380 (Autoelex Co, Южная Корея) при температуре 37,5–37,8 ºС, относительной влажности 45–50%, повороте лотков с периодичностью 1 час.
Сырьем для гидролиза служил обезжиренный сублимат эмбрионально-яичной массы, полученный из инкубированных до 10-х (HH36) суток куриных яиц.
Последовательный кислотно-ферментативный гидролиз осуществляли по ранее отработанной авторами схеме с использованием соляной кислоты и ферментов: алкалаза (активность 50 000 ед/г), нейтраза (активность 1,75 AU/г). Полученный гидролизат очищали микрофильтрацией с помощью системы фильтрации Vivaflow 50 (Sartorius, Франция) с полиэфирсульфоновыми мембранами 0,2 мкм. Затем проводили приготовление комплекса гидролизата с бета-циклодекстрином (βЦД). Раствор, содержащий βЦД и гидролизат (1:1), инкубировали при 50 °C в течение 60 мин. при постоянном перемешивании в шейкер-термостате ES 20/60 (Biosan, Латвия).
Для лиофильного высушивания полученный комплекс βЦД и гидролизата замораживали в морозильной камере («ПОЗиС», Россия) при температуре минус 38–40 °C в течение 4 ч. и дегидратировали в лиофильной сушилке BK-FD10Т (Biobase, Китай). Рабочее давление в сушильной камере — 1–2 Па, температура сублиматора — минус 60–65 °C. Температура высушиваемой субстанции за процесс сушки не превышала 28 °C. Время сушки 2,0 л образца — 28 ч.
Распылительную сушку комплекса β-циклодекстрина и гидролизата белков куриного эмбриона осуществляли на распылительной сушилке Mini spray dryer B-290 (Buchi, Швейцария) при температуре на входе 170 °C, на выходе 80 °C, аспирация 100%, скорость подачи образца 10 мл/мин, давление газа 4 бар, скорость сушки 0,6 л/ч. Общее время сушки 2 л образца составило 3,5 ч.
Насыпную плотность порошков рассчитывали в соответствии с ОФС «Насыпная плотность и плотность после уплотнения» измерением объема образца вещества известной массы в градуированном цилиндре и рассчитывали по формуле (1):
Растворимость образца определяли как массу порошка, которая может раствориться в единице объема дистиллированной воды при 25 °C до выпадения осадка и создании насыщенного раствора, и измеряли в г / 100 мл.
Объемные структурные свойства полученных порошков исследовали методом рентгеновской микротомографии на рентгеновском микрокомпьютерном томографе «Продис.Компакт» («Продис», Россия). Для исследования порошки были помещены в пластиковые пробирки без особого дополнительного уплотнения. Образцы сканировали при следующих параметрах: напряжение 40 кВ, ток 50 мкА, без фильтра, размер пикселя 22,35 мкм, время сканирования 50 мин.
Протокол сканирования включал поворот на 360° с шагом 0,3°, время экспозиции 1000 мс на изображение, усреднение изображения — 1. Управление сканированием и трехмерная реконструкция образцов были выполнены с помощью программы proDIS (версия 1.4, «Продис», Россия).
Для количественного анализа внутренней структуры и оценки рентгеноплотности в единицах шкалы Хаунсфилда (HU) использовали программное обеспечение CTAn (версия: 1.18.4.0, Bruker, Бельгия). Визуализацию структур осуществляли с помощью программы DataViewer (версия: 1.5.6.2, Bruker, Бельгия).
Внутренняя структура порошков была охарактеризована микротомографическими параметрами, такими как процент объема объекта (ПOО), отношение поверхности к объему (OПО), индекс фрагментации (ИФ), степень анизотропии (СФ), индекс моделирования структуры (ИМС).
Определение количества натрия хлорида проводили методом титрования.
Белки, пептиды, аминокислоты и другие продукты гидролиза определяли методом Варбурга— Кристиана.
Массовую долю низкомолекулярных производных белков (пептидов и аминокислот) определяли методом Варбурга — Кристиана после осаждения белков трихлоруксусной кислотой.
Массовую долю пептидов и аминокислот (МДПА) рассчитывали по формуле (2):
Содержание аминного азота определяли методом титрования формальдегидом.
Антиоксидантную активность определяли методом поглощения АБТС радикала. Для этого порошки растворяли в фосфатно-солевом буфере (PBS, pH 7,4) и исследовали после центрифугирования с использованием набора реагентов для количественной оценки антиоксидантной активности (FITCHEM) методом, описанным в предыдущей работе с некоторой модификацией. АБТС-активность по удалению радикалов выражали в мкМ эквивалентов тролокса на 1 г сухого вещества (мкМ ТЭ/г).
Статистическую обработку количественных данных проводили с использованием программного пакета Biostat (Primer of Bio-statistic version 4.03). Применяли однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA). Количественные данные представляли в виде М ± Sd (М — среднее значение, Sd — стандартное отклонение).
Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.
Результаты и обсуждение
Порошки комплексов β-циклодекстрина и смешанного гидролизата (соляная кислота, алкалаза, нейтраза) сублимата яично-эмбриональной массы получали методами лиофильной и распылительной сушки (рис. 1).
Выбранные методы сушки уже набрали популярность в пищевой и фармакологической промышленности. Лиофильная сушка выступает щадящей технологией дегидратации, обеспечивающей стабильность физико-химической и биологической активности пептидов. Распылительная сушка является широко используемой технологией микрокапсулирования благодаря низкой стоимости обработки и хорошей стабильности конечного продукта.
На рисунке 2 представлены полученные порошки комплексов β-циклодекстрина и гидролизата белков куриного эмбриона, высушенные методом лиофильной (βЦД-СГАНл) и распылительной (βЦД-СГАНр) сушки.
По внешнему виду порошок, полученный методом распылительной сушки, отличается более легкой текстурой, высоким уровнем равномерности и имеет более светлый оттенок. Визуализация порошков с применением рентгеновской микротомографии подтверждает более равномерный характер структур порошка, полученного методом распылительной сушки.
В отличие от длинных игольчатых структур лиофильно высушенного комплексаβЦД-СГАНл, порошок βЦД-СГАНр, полученный методом распылительной сушки, представлен в виде мелких округлых и неровных структур (рис. 3A).
Гранулометрический анализ исследуемых порошков показал, что и в комплексе βЦД-СГАНл, и в βЦД-СГАНр максимальное представительство имеют частицы 44,7–89,4 мкм. При этом порошок βЦД-СГАНл отличался более широким гранулометрическим составом (рис. 3Б).
Спектр размерного распределения частиц комплекса βЦД-СГАНл в сравнении с βЦД-СГАНр включал крупные частицы (71,5 мкм — 1,4 мм; 2,8–5,7 мм).
Стоит отметить, что время лиофильной сушки 2 л образца с учетом заморозки составил 32 ч., а того же объема методом распылительной сушки — 3,5 ч.
Анализ физико-химических показателей, представленных в таблице 1, свидетельствует об отсутствии достоверной разницы между порошками βЦД-СГАНл и βЦД-СГАНр по основным химическим показателям, характеризующим их биологически активные вещества.
Достоверное увеличение на 21,6% насыпной плотности при распылительной сушке подтверждает результаты, полученные при макро- и микровизуальном исследованиях и связаны с особенностями технологического процесса высушивания.
Общая рентгеноплотность порошка, полученного при распылительной сушке, закономерно увеличилась на 12,9%, что связано с его более низкой (в 3,26 раза) регистрируемой пористостью.
Крупные рентгеноконтрастные игольчатые структуры лиофильно высушенного комплекса не смогли полностью компенсировать по рентгеноплотности наличие в этом порошке значительных пустот (табл. 2).
Микроструктурный рентгеновский анализ показал достоверную разницу между расчетными индексами, характеризующими распределение визуализируемого объема частиц порошков, полученных различными методами высушивания. Индексы структурного разделения и выпуклости поверхности в порошке βЦД-СГАНр уменьшились, соответственно, на 30,5% и в 67,6 раза, что показывает большую равномерность структур и сглаживание визуального регистрируемого объема частиц порошка в общие структуры. Вышеприведенные выводы хорошо подтверждаются визуализацией при 2D-анализе.
Степень анизотропии является показателем трехмерной структурной симметрии, которая в данном случае указывает на наличие или отсутствие преимущественной ориентации частиц порошка. Значение 0 соответствует полной изотропии, 1 — полной анизотропии.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что структуры порошка, полученного методом распылительной сушки, стремятся к большей изотропии, чем полученные методом лиофильной сушки.
Однако, несмотря на общую положительную с точки зрения технологии и экономической эффективности характеристику распылительной сушки, обращает на себя внимание снижение почти в 2 раза антирадикальной активности. Выявленный авторами факт согласуется с результатами других работ, согласно которым скорость поглощения супероксидного аниона, гидроксильного радикала и 1,1-дифенил-2-пикрилгидразила (DPPH) оказались самыми высокими для порошка пептидного гидролизата белка утиного яйца, полученного лиофильно, и самыми низкими для порошка, полученного распылительной сушкой. Это может объясняться низкой температурой лиофильной сушки, препятствующей изменению пространственной структуры белковых пептидов и, следовательно, изменению их биоактивных свойств.
В то же время данные авторов идут в некий разрез с целым рядом результатов других исследователей, проводящих сравнительный анализ влияния лиофильной и распылительной сушек на биоактивные свойства белковых гидролизатов в пользу распылительной. Это, по всей видимости, обусловлено влиянием высокой температуры на биологически активные вещества, являющиеся донорами электронов для АБТС-радикала. Полагаем, данный факт может отрицательно сказаться и на других термолабильных соединениях, понизив различные специфические активности полученной субстанции. Вышесказанное еще раз подтверждает, что изменения условий распылительной сушки, таких как температура воздуха на входе и скорость потока подачи, могут по-разному влиять на гигроскопичность и морфологию частиц образца, физико-химические и, как следствие, биоактивные свойства белкового гидролизата. Поэтому комплекс бета-циклодекстрина и гидролизата белков куриного эмбриона целесообразно изучить при различных вариациях условий распылительной сушки, что и выступит целью дальнейшего исследования.
Выводы
В настоящем исследовании в оптимизированных условиях получен комплекс включения β-циклодекстрина со смешанным гидролизатом (пептидными фракциями) белков куриного эмбриона.
Полученные результаты доказывают возможность использования как распылительной, так и лиофильной сушки в целях стабилизации комплексов бета-циклодекстрина и гидролизатов белков куриного эмбриона. Однако для проведения высушивания методом распылительной сушки требуются совершенствование и отработка процесса с возможной корректировкой скорости подачи субстанции, температуры нагрева или дополнительного включения защитных компонентов в субстанцию перед высушиванием.
Об авторах
Игорь Владимирович Ржепаковский 1, кандидат биологических наук, доцент, ведущий научный сотрудник
irzhepakovskii@ncfu.ru http://orcid.org/0000-0002-2632-8923
Сергей Иванович Писков 1, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник
spiskov@ncfu.ru https://orcid.org/0000-0002-5558-5486
Светлана Суреновна Аванесян 1, научный сотрудник
savanesian@ncfu.ru https://orcid.org/0000-0003-3536-1247
Марина Николаевна Сизоненко 1, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник
msizonenko@ncfu.ru https://orcid.org/0000-0002-1009-7112
Сергей Николаевич Поветкин 1, кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры пищевых технологий и инжиниринга
spovetkin@ncfu.ru https://orcid.org/0000-0002-8293-3984
Людмила Дмитриевна Тимченко 1, доктор ветеринарных наук, профессор, главный научный сотрудник
ltimchenko@ncfu.ru https://orcid.org/0000-0003-2011-880X
Магомед Шамилович Шахбанов 1, младший научный сотрудник медико-биологического факультета
mshakhbanov@ncfu.ru https://orcid.org/0000-0003-2580-7233
Андрей Ашотович Нагдалян 1, кандидат технических наук, старший научный сотрудник
anagdalian@ncfu.ru https://orcid.org/0000-0002-6782-2821
Максим Борисович Ребезов 2, 3 доктор сельскохозяйственных наук, профессор, главный научный сотрудник 2; доктор сельскохозяйственных наук, профессор кафедры биотехнологии и пищевых продуктов 3
rebezov@ya.ru https://orcid.org/0000-0003-0857-5143
1 Северо-Кавказский федеральный университет, ул. им. Пушкина, 1, Ставрополь, 355002, Россия
2 Федеральный научный центр пищевых систем им. В.М. Горбатова Российской академии наук, ул. им. Талалихина, 26, Москва, 109316, Россия
3 Уральский государственный аграрный университет, ул. им. Карла Либкнехта, 42, Екатеринбург, 620075, Россия
УДК 637.4.04:66.047.3
DOI: 10.32634/0869-8155-2025-399-10-182-190
Просмотров: 191
