Транскрипты генов COL4A2, IRG1, MMP12 как потенциальные биомаркеры качества спермы быков
У крупного рогатого скота в результате криоконсервации наблюдаются повышенные риски повреждения ДНК мужских гамет и снижение подвижности и жизнеспособности сперматозоидов после размораживания на целых 50%. В последние годы использование различных омиксных технологий в области криобиологии спермы и разработка высокопроизводительных методов, таких как секвенирование транскриптома, позволили провести анализ экспрессии специфических генов и генетических вариаций сперматозоидов, что привело к более глубокому пониманию структурных и функциональных изменений, которые испытывает сперма во время процесса замораживания-оттаивания, а также к выявлению соответствующих биомаркеров криорезистентности. Таким образом, изменения транскриптома в сперматозоидах считаются одним из основных факторов, влияющих на криотолерантность спермы сельскохозяйственных животных.
Полногеномное РНК-секвенирование было проведено для сравнения профилей транскриптов сперматозоидов двух групп быков с высокими и низкими продуктивными характеристиками и разной криорезистентностью. Общая РНК была выделена из декриоконсервированных сперматозоидов быков двух групп и подвергнута РНК-секвенированию (платформа Illumina NextSeq 500). Массив транскриптов оценивали с помощью пакетов DESeq2, DESeq в сперматозоидах каждого быка. Идентифицировано несколько дифференциально экспрессируемых генов (DEG), связанных с воспалением (IRG1, MMP12), сперматогенезом (Col4A2,), которые преимущественно активировались в эякулятах с плохой криорезистентностью.
Цель исследований заключается в валидации трех транскриптов спермы генов-кандидатов COL4A2, IRG1, MMP12, полученных с помощью РНК-Seq и корреляционного анализа их уровня экспрессии с высокими и низкими показателями качества сперматозоидов быков голштинской породы.
Материалы и методы исследования
Для исследования в 2024 году были выбраны 6 быков от 1 года до 3 лет на АО «Невское» (г. Санкт-Петербург, Россия): 3 — со стабильно высокими показателями качества спермы после заморозки-оттаивания и 3 — регулярно производящие криочувствительное семя.
Всего исследованы 18 проб эякулята криоконсервированной спермы по 3 пайеты от каждого быка. Пробы свежего эякулята отбирали в утренние часы во время плановых заборов в соответствии с межгосударственным стандартом отбора неразбавленной спермы быков.
Процедура обработки спермы: объем каждой пробы нативной спермы составлял 1000–1500 мкл, концентрация варьировалась от 0,7 до 1,65 млрд клеток/мл. Криоконсервацию спермы проводили по следующей технологии: смешанный с разбавителем OptiXcell (IMV Technologies, Франция) в соотношении 1:1 эякулят быков (27 °С) охлаждали до 18–22 °С, после чего проводили итоговое разбавление, фасовку и эквилибрацию (экспозиция при 4 °С в течение 3–4 часов). Замораживание сперматозоидов производили при 145 °С в течение 7,5 минут и хранили при -196 °С в жидком азоте (IMV Technologies, Франция). Концентрация клеток в пайете достигала 4–9 × 106 клеток/мл. Очистку образцов спермы от соматических и мертвых клеток проводили путем градиентного центрифугирования с помощью раствора Фиколла.
Подвижность и концентрация половых клеток свежего эякулята были оценены на АО «Невское» с использованием камеры Маклера (Sefi Medical Instrument, Италия).
Анализ морфологии сперматозоидов проводили под иммерсией на световом микроскопе Olympus Vanox-t (Япония) (объектив х100) после окрашивания мазка эякулята с помощью тест-набора «Дифф-Квик» (ООО «НПФ “АБРИС+”», Россия) согласно рекомендациям производителя.
Анализ целостности мембран, жизнеспособности, мембранного потенциала митохондрий производили с помощью проточного цитометра CytoFLEX, BeckmanCoulter (США). Полученные данные анализировали с помощью программы CytExpert 2.4, BeckmanCoulter (США).
Для оценки мембранного потенциала митохондрий клетки сперматозоидов окрашивали флуоресцентным липофильным карбоцианиновым красителем JC-1 (Servicebio, Китай).
Оценку жизнеспособности и целостности клеточных мембран деконсервированных сперматозоидов проводили с помощью окрашивания интеркалирующими красителями: пропидиумом йодидом (Servicebio, Китай), контрастным красителем для ядер и хромосом, окрашивающим мертвые клетки и SYBR Green I («Евроген», Россия), специфичным к двухцепочечной ДНК для живых клеток.
Оценку внутриклеточного уровня кальция нативных и деконсервированных сперматозоидов проводили с помощью окраски Fluo-3 (Servicebio, Китай) живых и мертвых клеток, ранжированных окраской пропидиум йод.
Выделение РНК для ОТ-ПЦР проводили набором RNA solo («Евроген», Россия), в который уже включена обработка ДНКазой, в соответствии с рекомендацией производителя. По спектрофотометрическим показателям 260/280 образцы соответствовали диапазону 2–2,2 и 260/230 диапазону 1,8–2,2.
Дизайн олигонуклеотидов-праймеров для анализа экспрессии последовательности генов-кандидатов, влияющих на качество спермы, проводили на основании информации баз данных сети Интернет и при помощи компьютерной программы PRIMER_3.
Синтез однонитевой кДНК проводили при помощи обратной транскриптазы Mint («Евроген», Россия), следуя указаниям производителя. Реакция — в объеме 20 мкл.
Анализ экспрессии РНК, полученных из замороженно-оттаянной спермы быков, проводили с помощью олигонуклеотидов-праймеров (табл. 1).
Полученную смесь однонитевой кДНК использовали для амплификации с использованием 5х реакционной смеси qPCRmix-HS SYBR («Евроген»), предназначенной для ПЦР в реальном времени с интеркалирующим красителем SYBR Green I в соответствии с рекомендациями производителя в следующем режиме: амплификация кДНК и детекция сигнала (40 циклов): 95 °C — 5 мин.; 95 °C — 15 сек.; 59 °C — 15 сек.; 72 °C — 20 сек. (этап сбора данных). Реакции ПЦР в реальном времени для каждого образца проводили в трех повторностях. Для последующих расчетов использовали среднее арифметическое значение. Расчет изменений экспрессии отдельных молекул РНК выполняли методом -2dCt (delta Cycle threshold).
Статистическую обработку данных проводили в программе SigmaPlot 14 (Grafiti LLC) с применением ANOVA, однофакторного дисперсионного анализа Крускала — Уоллиса (англ. Kruskal — Wallis one-way analysis of variance), который предназначен для проверки равенства медиан нескольких выборок, при ненормальном распределении показателей признака. Нормальность распределения данных была проанализирована с помощью предположения ANOVA (тест Шапиро — Уилка). Представленные данные являются средними значениями трех экспериментальных повторов с тремя образцами на повтор. Данные представлены как среднее ± SEM (р < 0,05, рассчитано с использованием Дан метода и тест Tukey). Анализ ранговой корреляции был проведен по критерию Спирмена с помощью программы SigmaPlot 14 (Grafiti LLC, США).
Результаты и обсуждение
Анализ экспрессии генов COL4A2,IRG1, MMP12 в группах быков с низкими и высокими продуктивными признаками с помощью ОТ-ПЦР выявил, что относительная экспрессия была преимущественно выше в сперматозоидах быков, имеющих высокую продуктивность. Статистически достоверные различия уровней экспрессии сперматозоидов изучаемых генов были получены для всех генов в обеих группах быков (табл. 2).
Анализ корреляционных связей по критерию Спирмена выявил высокую зависимость между уровнем экспрессии исследуемых генов и значимыми показателями качества спермы.
Транскрипт гена COL4A2 показал высокую достоверную отрицательную корреляцию с благоприятными признаками для сперматозоидов, такими как подвижность (-0,926, р = 0,008), содержание живых клеток (-0,938, р = 0,005). Достоверную положительную корреляцию наблюдали для неблагоприятных признаков, таких как содержание мертвых (0,861, р = 0,027) и дефектные клетки (0,706, р = 0,013) (табл. 3).
Ген COL4A2 кодирует наиболее распространенный коллаген типа IV1, который является белком базальной мембраны и экспрессируется во всех тканях, включая стенки сосудов. В яичках самцов коллагеновые цепи типа IV и ламинины являются основными строительными блоками базальной мембраны. Первый отчет, иллюстрирующий важность коллагенов, поддерживающих сперматогенез, появился в 2003 году, когда было обнаружено, что использование антитела против цепей человеческого коллагена IV нарушает барьерную функцию проницаемости плотных межклеточных контактов клеток Сертоли.
Исследования показали, что пептидный фрагмент NC1 локально вырабатывается в яичках из цепи коллагена α3 (IV) посредством протеолитического расщепления матриксными металлопротеиназами (MMP) и является важнейшим регулятором множественных клеточных событий [15]. Отмечено, что сверхэкспрессия пептида NC1 была способна вызывать обратимое нарушение гемато-тестикулярного барьера (ГТБ) как in vitro, так и in vivo, что сопровождалось повреждением эпителия, отшелушиванием зародышевых клеток и дефектами сперматогенеза.
Транскрипт гена IRG1, как и транскрипт гена COL4A2, показал высокую достоверную отрицательную корреляцию с такими признаками сперматозоидов, как подвижность сперматозоидов (-0,727, р = 0,01), содержание нормальных (-0,794, р = 0,05) и живых (-0,794, р = 0,05) клеток и средним содержанием Ca2+(-0,883, р = 0,033). Положительная корреляция выявлена с содержанием мертвых (0,883, р = 0,033) и дефектных (0,0,659, р = 0,015) клеток, а также с дефектом акросомы (0,647, р = 0,017).
Иммунореактивный белок 1, кодируемый геном IRG1, преимущественно локализуется в митохондриях и высоко экспрессируется в макрофагах млекопитающих во время воспалительной реакции, обеспечивает активность аконитатдекарбоксилазы и участвует в нескольких процессах, включая клеточный ответ на стимул цитокина, отрицательную регуляцию защитного ответа и отрицательную регуляцию передачи сигнала. IRG1 является одним из генов, стимулируемых интерфероном (ISG), и связан с опосредованным IFN типа I уничтожением бактерий и вирусов путем катализа продукции итаконовой кислоты, также известную как метилен янтарная кислота.
Используя подход «приобретение и потеря функции» в иммунных клетках, как мышей, так и человека, авторы обнаружили, что уровни экспрессии IRG1 коррелируют с содержанием итаконовой кислоты, метаболита, который, как ранее уточнялось, обладает антимикробным эффектом и подавляет рост бактерий, экспрессирующих изоцитратлиазу, таких как Salmonella enterica.
Аналогичные наблюдения были проведены в микроглиальных клетках, где противовоспалительные состояния были вызваны различными цитокинами или бактериальными компонентами, и в исследовании профиля экспрессии генов мышиных макрофагов и микроглиальных клеток был выявлен ген IRG1 как один из наиболее высокорегулируемых генов при воспалительных состояниях, таких как бактериальные инфекции.
Повышенные уровни экспрессии IRG1 были обнаружены в макрофагах селезенки цыплят после заражения Salmonella enterica и могут играть решающую роль в чувствительности к вирусу болезни Марека. IRG1 высоко экспрессируется на начальных стадиях в клетках эндометрия, что приводит к имплантации зародыша в матку.
Транскрипт гена MMP12 имел противоположный эффект в сравнении с генами IRG1 и COL4A2. Достоверная высокая корреляция уровня экспрессии транскрипта MMP12 выявлена с подвижностью сперматозоидов (0,840, р = 0,036), и отрицательная корреляция с содержанием дефектных (-0,647, р = 0,017) и клеток (-0,750, р = 0,001) мертвых (табл. 3).
В предыдущем исследовании наблюдали, что два из ключевых генов IRG1, MMP12 с пониженной регуляцией, идентифицированные с помощью РНК-Seq анализа в эякулятах с плохой криорезистентностью, были преимущественно связаны с воспалением и иммунным ответом.
Матриксная металлопептидаза 12 (MMP12), также известная как макрофагальная металлоэластаза, вырабатывается в основном макрофагами и является членом семейства матриксных металлопротеиназ, участвует в различных физиологических функциях, включая катаболизм внеклеточного матрикса и деградацию эластина. MMP12 был идентифицирован как трансляционно-репрессированный кандидат во время раннего воспаления, который восстанавливался во время фазы разрешения. Ген MMP12 был выявлен в исследовании M. Atikuzzaman и соавт. как участвующий в иммуномодуляции и имеющий дифференциальную экспрессию в резервуарах спермы у птиц и млекопитающих в ответ на спаривание.
Выводы
Результаты валидации полногеномного секвенирования РНК сперматозоидов из двух групп быков с помощью ОТ-ПЦР показали, что относительная экспрессия исследуемых генов COL4A2, IRG1, MMP12 была достоверно ниже в сперматозоидах, имеющих низкую продуктивность, что подтверждает результаты полного транскриптомного анализа, где пониженная дифференциальная экспрессия наблюдалась в группе быков с плохой продуктивностью.
Транскрипт гена MMP12 показал достоверную высокую положительную корреляцию с подвижностью сперматозоидов и отрицательную с содержанием дефектных и мертвых клеток. Транскрипты генов IRG1 и COL4A2 показали высокую достоверную отрицательную корреляцию с некоторыми благоприятными признаками сперматозоидов, такими как подвижность сперматозоидов, содержание живых и нормальных клеток, среднее содержание Ca2, и положительную корреляцию с несколькими нежелательными признаками, такими как содержание дефектных и мертвых клеток, а также с дефектом акросомы.
Результаты исследования могут быть использованы для разработки транскрипционных маркеров, позволяющих отбирать сперму от быков-производителей с более высоким оплодотворяющим и криорезистентным потенциалом.
Об авторах
Ольга Юрьевна Баркова, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
barkoffws@list.ru https://orcid.org/ 0000-0002-0963-905X
Дарья Андреевна Старикова, кандидат биологических наук, научный сотрудник
live8avis@mail.ru https://orcid.org/0000-0001-5324-4090
Ирэна Валерьевна Чистякова, кандидат биологических наук, научный сотрудник
itjerena7@gmail.com https://orcid.org/0000-0001-7229-5766
Николай Вячеславович Плешанов, научный сотрудник
Klaus-90@list.ru https://orcid.org/0000-0002-4634-7515
Алина Валерьевна Габова, лаборант
https://orcid.org/0009-0007-6039-6958
Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных — филиал Федерального исследовательского центра животноводства «ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста», Московское шоссе, 55А, Пушкин, Санкт-Петербург, 196601, Россия
УДК 636.082.12
DOI: 10.32634/0869-8155-2025-395-06-81-86
