Температурная зависимость активности нового бактериофага в отношении возбудителя сосудистого бактериоза капусты Xanthomonas campestris pv. campestris
Сосудистый бактериоз капусты, вызываемый бактерией Xanthomonas campestris pv. campestris (далее — Xcc), является одним из наиболее экономически значимых заболеваний капустных культур в мире, особенно в регионах с теплым и влажным климатом. Патоген поражает сосудистую систему растения, вызывая хлороз, увядание и гибель надземных органов, что значительно снижает урожайность и товарные качества продукции. Проблема усугубляется локализацией патогена внутри тканей растения, высокой устойчивостью патогена к ряду химических средств защиты растений, а также отсутствием универсальных сортов с устойчивостью к различным расам Xcc. В последние годы интерес к биологическим методам защиты растений значительно возрос, что связано как с ужесточением норм по применению пестицидов, так и с ростом резистентности возбудителей к традиционным средствам защиты растений.
В условиях усиливающихся ограничений на использование пестицидов в растениеводстве особую актуальность приобретают экологически безопасные методы борьбы с бактериальными болезнями, такие как использование бактериофагов — вирусов, избирательно поражающих бактериальные клетки. Применение бактериофагов как элемента интегрированной системы защиты растений рассматривается как перспективный подход, однако остается недостаточно изученным.
Несмотря на ряд успешных примеров использования фагов в защите сои, картофеля и других культур, количество работ, посвященных именно фагам возбудителя сосудистого бактериоза капусты, ограничено. Holtappels et al. (2022) охарактеризовали новые Xcc-фаги — FoX2 и FoX6, указав на их потенциал как агентов биоконтроля патогена. Weiss et al. (1994) описали фаг XTP1, однако, кроме характеристики биологических особенностей, дальнейшего анализа не проводили. Большинство опубликованных данных носят фундаментальный характер и не учитывают таких критически важных факторов, как температурные колебания в условиях открытого грунта и их влияние на взаимодействие в системе «фаг — бактерия».
Фаги обладают высокой специфичностью к микробной клетке и, проходя репродукцию в ней, не влияют на растения и окружающую среду. Тем не менее эффективность фаготерапии в полевых условиях зависит от множества факторов, среди которых ключевыми являются температура, влажность, УФ-излучение и pH окружающей среды. В отличие от медицинских и ветеринарных объектов, где температура организма-хозяина стабильна, применение фагов в растениеводстве требует учета широких температурных колебаний, особенно при выращивании растений в открытом грунте.
Температура оказывает прямое влияние на скорость роста бактерий, активность фагов и эффективность лизиса. С другой стороны, температурный диапазон в агроценозах варьирует от 10 до 50 °C, и биопрепараты, предназначенные для полевых условий, должны демонстрировать устойчивость к таким колебаниям. В связи с этим возникает необходимость в исследовании температурной зависимости кинетики фаг-бактериального взаимодействия с целью оптимизации условий применения бактериофагов.
Цель работы — изучение влияния температуры на активность нового Xcc-фага Murka.
Материалы и методы исследования
Штаммы бактерий. Штаммы Xcc были выделены из растений семейства капустных (цветная и белокочанная капуста из России, Молдовы, Украины, Беларуси и Нидерландов) и пастушьей сумки (из Японии) с визуальными признаками сосудистого бактериоза в 1957–2017 гг. сотрудниками Российского государственного аграрного университета — МСХА им. К.А. Тимирязева (г. Москва, Россия) и Российского университета дружбы народов им. Патриса Лумумбы (г. Москва, Россия) или получены из международных микробиологических коллекций.
Поверхность стеблей и побегов дезинфицировали этанолом, некротизированные сосуды вырезали, измельчали в стерильной воде, гомогенизировали и распределяли по поверхности чашек со средой YDC (г/л: дрожжевой экстракт — 10,0, карбонат кальция (CaCO3) — 20,0, агар — 15,0, безводная глюкоза — 20,0). Чашки Петри инкубировали при 26 °C в течение 48 ч. Собирали слизистые колонии с желтой пигментацией, типичные для Хсс, и проводили 3-кратную рекультивацию для получения чистой культуры.
Для первичной характеристики штаммов был проведен тест на гидролиз крахмала в соответствии с Lee et al. (2020) с изменениями. Бактериальные изоляты наносили штрихом на чашки Петри с агаром, содержащим 0,2% растворимого крахмала, и инкубировали при 30 °C до начала интенсивного роста. Затем чашки заполняли раствором Люголя (йод — 1 г, калий — 1 г, йодид калия — 2 г, дистиллированная вода — 100 мл), и прозрачные зоны, свидетельствующие о гидролизе крахмала вокруг колоний, были идентифицированы как положительная реакция. Штамм 528T из Национальной коллекции фитопатогенных бактерий (NCPPB, Йорк, Великобритания) использовали в качестве эталонного штамма. Бактериальные культуры хранили в 15%-ном глицерине при температуре -72 °C для последующих тестов.
Тест на патогенность проводили в соответствии с Hakalova et al. (2018) с изменениями. Растения цветной капусты сорта Гарантия (восприимчивый стандарт) выращивали в зимней остекленной теплице при температуре 28/22 °C (14 ч днем / 10 ч ночью), естественной инсоляции и поливали по мере необходимости. Растения выращивали на торфоперлитовом субстрате («Велторф», Россия) в пластиковых лотках на 40 ячеек (объем ячейки 0,12 л, «Агрофлорапак», Россия) до фазы 3–4 настоящих листьев. Инокуляцию проводили путем прокалывания жилки листа иглой до этого погруженной в бактериальную суспензию в воде с концентрацией 109 КОЕ /мл.
Суспензии готовили из колоний штаммов, выращенных на среде Кинга Б при 26 °C в течение 48 ч путем суспендирования в стерильной воде, доводили до оптимальной концентрации, измеряя оптическую плотность при 600 нм с помощью спектрофотометра NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific, США). В качестве положительного контроля использовали суспензию штамма NCPPB 528T, а в качестве отрицательного контроля — стерильную воду. Каждым штаммом инокулировали по три растения. Регистрацию симптомов проводили на 12-й день после инокуляции. В дальнейшей работе использовали штаммы, которые вызывали типичные симптомы сосудистого бактериоза.
ДНК выделяли из двухдневных культур с использованием набора для выделения ДНК «Фитосорб» («Синтол», г. Москва, Россия) в соответствии с протоколом производителя. Реакционная смесь содержала 5 мкл 5 × Master-mix (5 × MasDDTaqMIX-2025, «Диалат», Россия), 10 пМ каждого праймера, 5 нг ДНК и воду без ДНК до объема 25 мкл. ПЦР-амплификацию проводили в термоциклере T100 (Bio-Rad, США). Для амплификации гена 16S рРНК использовали праймеры rD1 и fD1, описанные в работе Yinur et al. (2020) с добавлением двух нуклеотидов к прямому праймеру для увеличения температуры отжига. Ампликоны (размером около 1500 п. о.) были разделены с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозе в присутствии бромистого этидия в 0,5 × TBE и проанализированы с использованием Gel Doc XR+ (BioRad, США). Продукты ПЦР были выделены и очищены с использованием набора ColGen («Синтол», Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. Секвенирование очищенных фрагментов ПЦР проводили на автоматическом секвенаторе DNA Analyzer 3730 с набором BigDye Terminator v3.1 (Thermo Fisher Scientific, США).
Выделение и характеристика фага Murka. Бактериофаг Xcc Murka был выделен из образца почвы, взятого на поле, где в 2012 году произошла массовая вспышка сосудистого бактериоза капусты, недалеко от Тирасполя (Приднестровье, Молдова). Фаг размножали с использованием штамма Xcc Tr1 при 26 °C в соответствии с ранее опубликованным протоколом. Лизат обрабатывали хлороформом, а осадок концентрировали центрифугированием при 8000× g в течение 20 мин с последующей фильтрацией надосадочной жидкости через мембранные фильтры с размером пор 0,22 мкм (Millex-GV, Millipore, Cork, Ирландия) и впоследствии добавляли ДНКазу I (0,5 мг/мл, 1 ч; «Евроген», Россия).
Фильтраты фагов концентрировали ультрацентрифугированием при 100 000× g при 4 °C в течение 2 ч с использованием ротора Beckman SW28 (Beckman Coulter, США). Очистку фагов проводили ультрацентрифугированием в ступенчатом градиенте CsCl (0,5–1,7 г/мл) при 22000×g в течение 2 ч. Фагосодержащую опалесцирующую полосу собирали и подвергали диализу с использованием буфера SM (10 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ MgSO4, 100 мМ NaCl). Суспензию фага хранили при температуре 4 °C.
Для оценки диапазона хозяев среди циркулирующих штаммов Xcc была проведена проверка на фаговую инфекционность в отношении 14 штаммов. Набор штаммов включал один эталонный штамм из коллекции NCPPB и 13 полевых изолятов. Для анализа 5 мкл суспензии фага с титром 107 БОЕ (бляшкообразующих единиц) / мл вносили на двухслойный агар Кинга Б, содержащий бактериальный штамм, и инкубировали в течение ночи при 26 °С. Наличие литической активности определяли по образованию зон лизиса культуры. Для исключения ложноположительных результатов для образцов с положительной реакцией было проведено титрование фагов.
Оценка влияния температуры культивирования на кинетику взаимодействия фага и бактерии. Рост бактерий в присутствии или в отсутствие фага при различных температурах проводили в условиях персонального мультиканального биореактора Biosan RTS-8 (Biosan, Латвия), согласно, с модификациями. Для этого 15 мл стерильной жидкой среды Кинга Б и 100 мкл ночной культуральной суспензии штамма Tr1 (2,5 × 109 КОЕ/мл; OD600 ≈ 0,21) асептически переносили в пробирки для культивирования. Затем в пробирки для культивирования добавляли (не добавляли) по 100 мкл суспензии фагов (1,2 × 106 БОЕ/мл при MOI = 0,001). Это позволило провести параллельные измерения в пробирках, обе из которых содержали бактерию, а одна — дополнительно фаг, тем самым смоделировав ситуацию, в которой суспензия фага попала на бактерии в растении. Пробирки помещали в биореактор и культивировали при температурах 15 ºС, 20 ºС, 25 ºС, 30 ºС, 35 ºС, 40 ºС или 45 °C при 1300 об/мин в обратном вращении каждые 3 сек в течение 48 ч, OD600 определяли автоматически каждые 6,5 мин. После отбора образцы очищали с помощью хлороформа и титровали на верхнем агаре с штаммом Tr1 методом серийных разведений. Эксперимент проводили в двух повторностях (по две пробирки для культивирования на вариант).
Кривые роста были построены и использованы для расчета площади под кривыми роста (AUGC-Area under growth curve) с использованием GraphPad Prism 9.2.0 (GraphPad Software Inc., США) согласно. Скорость роста оптической плотности бактерий определяли путем вычисления отношения OD в конечной точке к OD в начальной точке логарифмической фазы и деления на продолжительность логарифмической фазы.
Статистический анализ. Статистическую обработку данных проводили с использованием метода дисперсионного анализа в программе Statistica 12.0 (StatSoft, США), сравнивая средние значения по критерию Дункана. Графики строили с помощью GraphPad Prism 9.2.0 (GraphPad Software Inc., США).
Результаты и обсуждение
Штаммы бактерий. Штаммы бактерий были охарактеризованы авторами ранее в работе, и их основные характеристики представлены в таблице 1. Референтный штамм Xcc NCPPB 528T использовали в качестве эталона для сравнения с местными изолятами Xcc во всех экспериментах.
Все отобранные штаммы были: (i) высоковирулентными в отношении восприимчивых растений при искусственной инокуляции; (ii) идентичными штамму Xcc NCPPB 528T по морфологии колоний на питательной среде YDC; (iii) положительными в тесте на гидролиз крахмала, который является диагностическим признаком рода Xanthomonas; (iv) имели наиболее схожие (> 95%) последовательности фрагментов гена 16S рРНК с соответствующими последовательностями эталонных штаммов Xcc в NCBI GenBank. Аннотированные последовательности гена 16S рРНК штаммов Xcc были депонированы в NCBI GenBank; регистрационные номера приведены в таблице 1.
Характеристика Xcc-фага Murka. Xcc-специфичный бактериофаг Murka был выделен из образца почвы из Молдовы. Активность выделенного фага была протестирована против ряда штаммов Xcc, что привело к лизису 9 из 14 протестированных штаммов Xcc (табл. 1). Таким образом, фаг лизировал большинство штаммов возбудителя, циркулирующих в центре европейской части России, за исключением одного штамма из Московской области. Протестированные штаммы из Беларуси, Украины, Нидерландов и Великобритании оказались устойчивыми к фагу Murka.
Фаг Murka почти полностью адсорбировался на клетках штамма-хозяина Xcc Tr1 (92,4%) в течение 13 мин при температуре 26 °C и лизировал бактерии в течение 100 мин, образуя 97±21 частицу потомства на инфицированную бактериальную клетку. Было обнаружено, что фаг устойчив к повышенным концентрациям хлороформа: титр незначительно снижался только при 75%-ной концентрации в растворе. Ультрафиолетовое облучение (280–315 нм) снижало жизнеспособность фага пропорционально времени обработки с полным уничтожением через 30 мин. Фаг был стабилен в диапазоне рН 6–10 при 26 °C в течение 1 ч, но быстро терял жизнеспособность при рН 3–5 и 11–12. Инфекционная способность фага Murka значительно снижалась при температурах выше 50 °C. В частности, суспензия фага с концентрацией 107 БОЕ/мл теряла 50% своей жизнеспособности при 50 °C в течение 1 ч. Оптимальная температура длительного хранения фагов составляла около 4 °C.
В стандартных условиях размножения бактерии–хозяина фаг Murka образует небольшие бляшки (Ø1–2 мм) с гладкими границами и неправильной формой. Морфология фага, выявленная с помощью просвечивающей электронной микроскопии, продемонстрировала внешний вид, типичный для Mioviruses; капсулы были икосаэдрическими и имели диаметр ~56 нм. Хвост длиной около 108 нм был соединен с головкой через тонкую шейку, и никаких выраженных волокон (шипов) в адсорбционном аппарате обнаружено не было.
Фаг Xanthomonas Murka (регистрационный № GenBank OR500351) имеет геном в виде двухцепочечной ДНК, состоящий из 43 277 пар оснований. Содержание GC в геноме составляет 59,6% и равномерно распределено по всей длине генома. Среднее содержание GC в 78 штаммах Xanthomonas campestris pv. campestris, содержащихся в базе данных NCBI ReSeq, составляет 65,1%, что заметно выше, чем содержание GC в геноме фага. В геноме Murka предсказано 83 гена ORF. 41-му белку были присвоены предполагаемые функции, а 42 гена были аннотированы как кодирующие гипотетические белки. В геноме не было обнаружено ни одного гена тРНК.
Генетический анализ с использованием последовательностей фага Murka показал, что ближайшими родственниками фага являются Foxunaviruses. Поиск выявил родственные фаги, инфицирующие бактерии, отличные от Xanthomonas, включая фаг Burkholderia Mica (род Micavirus), фаг Achromobacter Mano (род Manovirus), фаг Acinetobacter Alexa (не классифицирован), фаг Escherichia vB_EcoM-ep3 (род Jilinvirus) и фаг Serratia MQ-4. Результаты сравнительного анализа геномов показали сходство геномной организации между этими фагами, Foxunaviruses и фагом Murka. Полная характеристика фага представлена в предыдущей статье авторов.
Влияние температуры культивирования на кинетику взаимодействия фага и бактерии. Способность фага длительное время существовать в ризосфере или на поверхности растения при различных температурах является важным технологическим параметром, характеризующим возможное применение фага. Авторами было проведено исследование влияния температуры на кинетику взаимодействия фага с хозяином в модельных экспериментах в условиях биореактора. Во всех вариантах присутствие фага в смеси снижало оптическую плотность бактериальной суспензии при 600 нм, но это различие зависело от температуры. Было показано, что температура является одним из основных факторов роста штамма Tr1. Так, например, самые низкие значения OD600 были получены при культивировании при температурах 15 ºС и 45 °C (на пике 2,68 ед. и 1,1 ед. OD соответственно), в то время как при оптимальных значениях для роста бактерий (30 ºС и 35 °C) значения OD были самыми высокими и находились на пике при 2,68 ед., 11,77 ед. — при температуре 30 °C, 9,3 ед. — при температуре 35 °C (рис. 1).
Анализ площади под кривой (AUGC) показал следующие результаты: максимальные значения показателя наблюдались при культивировании без фага при температуре 30 °C (3055 ед.) и с фагом при температуре 35 °C (648,4 ед.); наименьшие значения наблюдались без фага при температуре 15 °C (466,7 ед.) и с фагом при температуре фаг при температуре 15 °C (73,88 ед.) (рис. 2А).
Расчет скорости роста оптической плотности бактерий в логарифмической фазе привел к нескольким интересным результатам. К примеру, максимальные значения показателя наблюдались при культивировании без фага при температуре 20 °C (0,3 ед/ч) и с фагом при температуре 45 °C (0,06 ед/ч).; самые низкие значения наблюдались в варианте без фага при температуре 15 °C (0,113 ед/ч) и с фагом при температуре 20 °C (0,001 ед/ч) (рис. 2Б).
Температура влияла на накопление вирусных частиц в растворе с течением времени. Эксперименты показали, что самые высокие значения титра фага наблюдались при температурах культивирования 20 ºС, 25 ºС и 30 °C. При других температурах конечный титр фага резко снижался по сравнению с 20 °C, на 91,7% — при 15°C, на 99,9% — при 45 °C (рис. 3). Таким образом, было показано, что для фага Murka оптимальные температуры для размножения находятся в диапазоне 20–30 °C.
Обсуждение. Сосудистый бактериоз капусты, вызываемый Xcc, является одним из наиболее известных бактериальных заболеваний растений, приводящим к потере урожая и качества капустных культур. В настоящее время борьба с болезнью носит комплексный характер. Следуя тенденции к сокращению использования пестицидов при производстве растениеводческой продукции и необходимости повышения качества продукции, актуальная задача состоит в разработке и внедрении новых методов защиты растений. Недавно были предложены альтернативные методы борьбы с Xcc, включающие использование индукторов устойчивости совместно с бактериями-антагонистами, растительными пестицидами и РНК-интерференцией.
Отличительной особенностью выращивания овощных культур в открытом грунте является широкий диапазон сезонных и суточных колебаний температуры воздуха и почвы. Для возбудителей болезней человека и сельскохозяйственных животных влияние температуры на эффективность обработки фагами нивелируется стабильной температурой тела, в то время как для растений эта температура подвержена резким сезонным и суточным изменениям.
В связи с этим одной из целей исследования была оценка кинетических параметров системы «фаг — бактерия» путем моделирования ее в биореакторе. Для этого температуру выращивания варьировали от 15 до 45 °C, что соответствовало обычному температурному спектру в период вегетации капусты в открытом грунте в большинстве климатических зон.
Было установлено, что температура оказывает сильное влияние на накопление бактериальной биомассы, причем оптическая плотность была самой высокой при температуре 30 °C.
С другой стороны, из ранее опубликованных работ следует, что оптимальная температура для культивирования Xcc составляет 25–27 °C. Тот факт, что штаммы Xcc различаются по оптимальной температуре роста, коррелирует с вариабельностью кластера генов, контролирующих липополисахаридный комплекс. Модельный штамм Tr1, используемый в данной работе, относится к серотипу 1 (с LPS, сходным со штаммами B100/3811/PHW231), поэтому, оптимальная температура для роста этого штамма выше, чем для штамма типа Xcc NCPPB 528T и аналогичных штаммов.
Температура влияла на накопление фаговых вирионов. Оптимальная температура для увеличения концентрации вируса находилась в диапазоне от 20 до 30 °C, в то время как при других температурах концентрация вирусных частиц снижалась до 99% (например, при температуре 45 °C). Таким образом, ингибирование фагом роста бактерий менее эффективно при высоких температурах из-за более низкой скорости развития фагов. Это указывает на отсутствие специального механизма термозависимой устойчивости фагов к Xcc. С другой стороны, широкий диапазон температур (20–30 °C), при котором Murka способна эффективно уничтожать бактерии, косвенно указывает на то, что ее можно использовать в различных климатических зонах, что является ценным свойством для перспективного биологического средства для борьбы с сосудистым бактериозом капусты.
Предпочтительным способом обработки растений капусты фагом является обработка семян перед посевом, поскольку (1) молодые всходы наиболее восприимчивы к бактерии; (2) во время прорастания семена интенсивно увеличивают площадь поверхности как корней, так и стебля. Полагаем, что фаг предотвратит колонизацию бактериями поверхности растения и их попадание в сосудистую систему из почвы; (3) при посеве семян капусты в поле или теплице температура почвы довольно низкая, и фаг находится в стабильных условиях. Эти моменты будут рассмотрены в будущих экспериментах.
Считается, что из-за длительной совместной эволюции бактерии-хозяина и фага оптимальная температура (как для метаболизма бактерии-хозяина, так и для процессов заражения фагом) стала близка. Однако данная работа и ряд других публикаций показывают, что температуры культивирования, отличные от оптимальных для бактерии-хозяина, могут повысить продуктивность вируса. Например, для низкотемпературного (LT) типа фага Aeromonas hydrophila известно, что субоптимальная (более низкая) температура для бактерии может влиять на адсорбцию фага на бактериальных клетках и его размножение.
Несмотря на то что оптимальная температура для культивирования Escherichia coli составляет 35–37 °C, максимальный выход фагов был обнаружен при температуре 30 °C. По-видимому, снижение выхода фаговых частиц при температурах, повышенных для развития бактерии-хозяина, происходит из-за образования не полностью собранных частиц, а также потому, что, по-видимому, температура больше всего влияет на конечную стадию сборки фага.
Таким образом, температура культивирования оказывает непосредственное влияние не на сам бактериофаг, который не имеет признаков самостоятельного метаболизма, а на бактерию и систему «фаг — бактерия» в целом. В вариантах культивирования фага при температуре 15–30 °C наблюдалась тенденция к увеличению OD600 к концу периода культивирования (с 23 до 47 ч), тогда как в случае культивирования при температуре 45 °C этого не наблюдалось. Это может быть связано с появлением устойчивых к фагам форм. Одним из способов решения этой проблемы является использование «фаговых коктейлей», включающих представителей разных групп фагов, при обработке растений для снижения риска появления устойчивых форм.
Выводы
Авторами охарактеризован новый фаг Murka, который приводит к лизису 64,3% штаммов возбудителя сосудистого бактериоза капусты Xanthomonas campestris pv. campestris, использованных в исследовании. Он имеет типичную морфологию миовируса и относится к роду Foxunavirus. Модельный эксперимент, проведенный в условиях жидкой культуры в биореакторе, показал, что оптимальный температурный диапазон для достижения максимальной продуктивности фага составляет 20–30 °C. Этот факт указывает на возможность использования фага в различных климатических зонах, что является ценным свойством для перспективного биологического средства борьбы с сосудистым бактериозом капусты. Для проверки этого предположения необходимы испытания на растениях в условиях искусственного инфекционного фона.
Об авторах
Рашит Ислямович Тараканов 1, кандидат биологических наук, доцент кафедры защиты растений
r.tarakanov@rgau-msha.ru https://orcid.org/0000-0002-3235-8467
Пётр Владимирович Евсеев 2, кандидат биологических наук, заведующий лабораторией молекулярной микробиологии
petevseev@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-1646-9802
Светлана Ивановна Чебаненко 1, кандидат сельскохозяйственных наук, доцент кафедры защиты растений
svchebanenko@rgau-msha.ru https://orcid.org/0000-0002-6128-1948
Ольга Алексеевна Савоськина 1, доктор сельскохозяйственных наук, профессор кафедры земледелия и методики опытного дела
osavoskina@rgau-msha.ru https://orcid.org/0000-0002-1568-4922
Оксана Григорьевна Каратаева 1, кандидат экономических наук, доцент кафедры педагогики и психологии профессионального образования
okarataeva@rgau-msha.ru https://orcid.org/0000-0001-5016-225X
Кирилл Максимович Воробьёв 1, магистрант кафедры защиты растений
kirillvrbv@mail.ru https://orcid.org/0009-0005-1858-1346
Февзи Сеид-Умерович Джалилов 1, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой защиты растений
dzhalilov@rgau-msha.ru https://orcid.org/0000-0002-5014-8375
1 Российский государственный аграрный университет — МСХА им. К.А. Тимирязева, ул. Тимирязевская, 49, Москва, 127434, Россия
2 Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова, ул. им. Островитянова, 1, Москва, 117513, Россия
УДК 632.937.2
DOI: 10.32634/0869-8155-2025-396-07-137-145
