• Зоотехния и ветеринария
• Научные исследования

29.05.2026

Способы проведения ПЦР в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по анализируемым SNP-маркерам гена iNOS

Индуцибельная синтаза оксида азота (iNOS) — ключевой фермент, катализирующий синтез оксида азота (NO) и его реактивных форм. Эти молекулы играют важную роль: выступают медиаторами врожденного иммунитета, подавляя патогены, и регулируют апоптоз, влияя на патофизиологические процессы.

Исследования полиморфизма гена iNOS Bos taurus приобретают особую значимость в контексте генетической селекции. Установленная ассоциация его аллельных вариантов с устойчивостью к лейкозу и молочной продуктивностью делает этот локус перспективной мишенью для разработки стратегий сохранения здоровья стада и повышения его продуктивности.

Для оценки генетического разнообразия в локусе iNOS широко применяется метод полимеразной цепной реакции, совмещенный с анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ-анализ), позволяющий идентифицировать полиморфные маркеры через рестрикцию амплифицированных фрагментов ДНК. Данный метод использован при разработке способов ПЦР-ПДРФ-генотипирования крупного рогатого скота по SNP-маркерам (Single Nucleotide Polymorphism — однонуклеотидный полиморфизм), локализованным в анализируемом локусе гена.

Корректная детекция ряда полиморфных маркеров может быть осуществлена с использованием модифицированной методики dCAPS (Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequences — производные расщепленные амплифицированные полиморфные последовательности), создающей искусственный сайт рестрикции за счет реконструированного праймера, а также прямым секвенированием ПЦР-продукта, обеспечивающим точное определение нуклеотидных замен.

При этом наряду с вышеперечисленными ДНК-технологиями могут быть востребованы и способы проведения ПЦР в реальном времени в формате гибридизационно-флуоресцентной детекции однонуклеотидных полиморфизмов благодаря их экспрессности.

Интеграция разрабатываемых диагностикумов в систему молекулярно-генетического тестирования племенного поголовья способствует не только выявлению ассоциаций между SNP-маркерами и хозяйственно ценными признаками, но и формированию высокопродуктивных и генетически резистентных к лейкозу популяций крупного рогатого скота, что является ключевым направлением современной селекционной практики.

Цель исследования — разработка способов проведения ПЦР в реальном времени в формате гибридизационно-флуоресцентной детекции однонуклеотидных полиморфизмов для генотипирования крупного рогатого скота по SNP-маркерам AH13-1 и AH13-6 гена iNOS.

Материалы и методы исследования

Исследование выполнено в лаборатории лейкозологии Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук в 2024 году.

Экстракция нуклеиновых кислот из 100 отобранных проб цельной консервированной крови голштинизированного скота черно-пестрой породы проведена комплектом реагентов для выделения ДНК из клинического материала «ДНК-сорб B» (ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия).

Дизайн олигонуклеотидов для проведения ПЦР в реальном времени в формате гибридизационно-флуоресцентной детекции с целью идентификации аллелей и генотипов SNP-маркеров AH13-1 и AH13-6 гена iNOS Bos taurus выполнен в программе OligoAnalyzer 1.2 (Teemu Kuulasma, Финляндия).

Перечень сконструированных олигонуклеотидов, включающий для определенного SNP-маркера свой набор из 5^’-флуоресцентно-меченых аллель-специфических праймеров, антипраймера, меченого гасителем флуоресценции с 3^’-конца олигонуклеотида, а также общего праймера, представлен в таблице 1.

Способы проведения ПЦР в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по SNP-маркерам AH13-1 и AH13-6 гена iNOS выполнены на амплификаторе Tianlong Gentier 96E (Tianlong, Китай). Готовые реакционные смеси объемом по 20 мкл включали в себя 14,2 мкл стерильной воды, 2 мкл dNTPs (2,5 мМ исходной концентрации каждого трифосфата), 2 мкл стандартного буфера для Taq ДНК полимеразы (10×), 0,2 мкл Taq ДНК полимеразы (5 ед.), 0,2 мкл микса 5^’-флуоресцентно-меченых аллель-специфических праймеров (25 мкМ каждого праймера), 0,2 мкл антипраймера (50 мкМ), 0,2 мкл общего праймера (50 мкМ), 1 мкл пробы ДНК 1-го раунда ПЦР.

Режимы термоциклирования и детекции для SNP-маркера AH13-1: ×1: 94 °С – 4 мин.; ×20: 94 °С — 10 сек., 60 °С — 10 сек., 72 °С — 10 сек., 50 °С — 10 сек. (FAM — канал детекции № 1 / VIC — канал детекции № 2). Режимы термоциклирования и детекции для SNP-маркера AH13-6: ×1: 94 °С — 4 мин.; ×20: 94 °С — 10 сек., 65 °С — 10 сек., 72 °С — 10 сек., 55 °С — 10 сек. (ROX — канал детекции № 3 / Cy5 — канал детекции № 4).

Постановка 1-го раунда ПЦР с праймерами iNOS-F и iNOS-R для амплификации локуса гена iNOS Bos taurus длиной 258 bp осуществлена набором реагентов Encyclo Plus PCR kit (ЗАО «Евроген», Россия) согласно ранее использованному протоколу [13]. Дополнительно проведенная полугнездовая ПЦР с праймерами iNOS-F1 и iNOS-R для амплификации локуса гена iNOS Bos taurus длиной 209 bp выполнена с Taq ДНК полимеразой со стандартным буфером (ООО «СибЭнзайм», Россия).

Процедура эндонуклеазного расщепления наработанных с праймерами iNOS-F1 и iNOS-R ампликонов осуществлена рестриктазами, подобранными для определенного SNP-маркера. В частности, для детекции полиморфных позиций SNP-маркера AH13-1 10 мкл амплификата смешивали с равным объемом ПДРФ-смеси, содержащей 2 ед. BstACI в SE-буфере W (ООО «СибЭнзайм», Россия) или 2 ед. BstACI и 5 ед. HaeIII в SE-буфере G (ООО «СибЭнзайм», Россия), инкубируя в термостате при 37 °С в течение 4 часов. Аналогичный объем амплификата и ПДРФ-смеси, а также схожее время инкубирования использовали и при детекции полиморфных позиций AH13-6 (5 ед. HinfI в SE-буфере O (ООО «СибЭнзайм», Россия).

Инкубированные ПЦР-ПДРФ-пробы, окрашенные буфером для нанесения образцов ДНК 4X Gel Loading Dye, Blue (ЗАО «Евроген», Россия), вносили в лунки 3%-ного агарозного геля в объеме 20 мкл и подвергали горизонтальному электрофорезу в ТAE буфере (pH 8,0) (ЗАО «Евроген», Россия) с последующей визуализацией электрофореграмм в УФ-трансиллюминаторе.

Результаты и обсуждение

Авторами разработаны способы проведения ПЦР в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по SNP-маркерам AH13-1 и AH13-6 гена iNOS в формате гибридизационно-флуоресцентной детекции, предусматривающие использование для определенного полиморфного маркера своего набора модифицированных и немодифицированных олигонуклеотидов, куда входят 5′-флуоресцентно-меченые аллель-специфические праймеры (70C-F + 70T-F для AH13-1 и 82C-R + 82T-R для AH13-6), общий праймер (82-R для AH13-1 и 70-F для AH13-6), и антипраймер (70-S для AH13-1 и 82-S для AH13-6), меченый гасителем флуоресценции с 3′-конца олигонуклеотида.

Локализация сконструированных олигонуклеотидов во фланкируемой ими области гена iNOS Bos taurus отображена на рисунке 1.

Наглядный пример результата тестирования разработанного способа проведения ПЦР в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по SNP-маркеру AH13-1 представлен на рисунке 2.

Примечание: кинетические кривые роста сигнала флуоресценции, характерные для генотипа СС (канал FAM, зеленая линия), генотипа TT (канал VIC, голубая линия) и генотипа CT (каналы FAM и VIC, зеленая и голубая линии). Ось ординат отражает относительные единицы флуоресценции (RFU). Ось абсцисс отражает циклы амплификации.

Другой пример результата тестирования еще одного предложенного способа проведения ПЦР в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота уже по SNP-маркеру AH13-6 наглядно продемонстрирован на рисунке 3.

В результате тестирования разработанных способов проведения ПЦР в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по SNP-маркерам AH13-1 и AH13-6 получены обеспечиваемые предложенными генодиагностическими подходами технические результаты, выраженные в эффективной идентификации искомых генотипов определенных полиморфных маркеров ввиду корректной интерпретации данных кривых роста сигнала флуоресценции (рис. 2, 3).

Предложенные способы, протестированные в настоящей работе, относятся к разновидности антипраймер-опосредованной количественной ПЦР в реальном времени (antiprimer-based quantitative real-time PCR, aQRT-PCR) [16], способной эффективно идентифицировать однонуклеотидный полиморфизм. При этом основное отличие от прототипа кроется в конструктивной особенности 5′-флуоресцентно-меченых аллель-специфических праймеров, полностью состоящих из ген-специфичных последовательностей, 5′-концевые участки которых способны к конкурентной гибридизации с комплементарным антипраймером, меченым гасителем флуоресценции с 3′-конца олигонуклеотида.

Следует отметить, что достоверность полученных результатов подкреплена данными ПЦР-ПДРФ-анализа с подобранными наборами праймеров и рестриктаз, в том числе способных к идентификации генотипов SNP-маркеров AH13-1 и AH13-6.

В настоящем исследовании сконструированный dCAPS праймер iNOS-F1 применен в статусе внутреннего олигонуклеотида в полугнездовой ПЦР вместе с внешним праймером iNOS-R, инициирующим амплификацию локуса гена iNOS Bos taurus длиной 209 bp.

Локализация использованных праймеров во фланкируемых ими областях локуса гена iNOS отображена на рисунке 4.

Помимо этого, на рисунке 4 представлены и полиморфные сайты рестрикции SNP-маркеров AH13-1 и AH13-6, а также соответствующие ПЦР-ПДРФ-профили их возможных генотипов, сгенерированные при рестрикционном картировании анализируемой последовательности ДНК, ограниченной уже внутренним (iNOS-F1) и внешним (iNOS-R) праймерами (рис. 4).

Наглядные примеры полученных электрофореграмм ПЦР-ПДРФ-профилей генотипов SNP-маркеров AH13-1 и AH13-6 гена iNOS Bos taurus, сгенерированныхс отобранными праймерами и рестриктазами, представлены на рисунке 5.

На них в общей сложности запечатлены ПЦР-ПДРФ-профили трех генотипов SNP-маркеров AH13-1 (TT, CC, CT), а также двух генотипов AH13-6 (CC иCT). Третий генотип TT SNP-маркера AH13-6 в ходе генотестирования в исследуемой выборке крупного рогатого скота не выявлен.

Полученные результаты генотестирования с внутренним (iNOS-F1) и внешним (iNOS-R) праймерами в постановке полугнездовой ПЦР и отобранными рестриктазами согласуются с результатами ранее проведенной гнездовой ПЦР с внутренними (iNOS-F1 и iNOS-R1) праймерами и последующего ПДРФ-анализа для идентификации SNP-маркеров гена iNOS крупного рогатого скота [17], что свидетельствует об их достоверности.

Выводы

Разработанные способы проведения ПЦР в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по SNP-маркерам AH13-1 и AH13-6 гена iNOS являются действенными подходами к идентификации искомых однонуклеотидных полиморфизмов. Гибридизационно-флуоресцентный формат детекции использованной разновидности антипраймер-опосредованной ПЦР в реальном времени обеспечивает корректную интерпретацию данных кривых роста сигнала флуоресценции.

Достоверность полученных результатов подкреплена ПЦР-ПДРФ-анализом с подобранными наборами праймеров и рестриктаз, способных к идентификации генотипов SNP-маркеров AH13-1 и AH13-6 гена iNOS Bos taurus. Однако, в отличие от ПЦР-ПДРФ-анализа, предложенные способы проведения ПЦР в реальном времени не требуют времязатратных процедур эндонуклеазного расщепления и последующего электрофоретического разделения генерируемых фрагментов.

Об авторах

Рамиль Ришадович Вафин, доктор биологических наук, профессор РАН, научный консультант
vafin-ramil@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-0914-0053
Хамид Халимович Гильманов, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
gilmanov.xx@mail.ru https://orcid.org/0000-0001-7053-6925
Федеральный научный центр — Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко РАН, Рязанский пр-т, 24, Москва, 109428, Россия