Разработка тест-систем для анализа полиморфизма генов TNFAIP3 и CDS1, ассоциированных с толщиной шпика у свиней
Одним из перспективных подходов для будущего развития селекционного процесса является использование метода геномной селекции, а именно повышение точности оценки племенной ценности путем идентификации SNP в специфических генах, вовлеченных в формирование хозяйственно значимых и экономически значимых признаков. В свиноводстве одной из главных задач при проведении селекционной работы является повышение продуктивности. В настоящее время имеется большое количество исследований, посвященных ассоциациям различных генов с хозяйственно полезными признаками у свиней. Например, ген DMD, обусловливающий наличие стресс-синдрома, ген гормона роста GH, ген ESR эстрогенового рецептора, ген рецептора меланокортина MC4R и ген PRLR пролактинового рецептора.
Развитие молекулярно-генетических методов исследований с помощью чипов различной плотности и последующие полногеномные ассоциативные исследования (GWAS) позволили идентифицировать большое количество новых генов, потенциально ассоциированных с селекционно значимыми признаками. Определение таких генотипов у свиней позволяет проводить отбор животных с предпочтительными (с точки зрения селекции) вариантами признаков. Проведение GWAS-анализа по показателям скороспелости свиней, их мясным, откормочным и воспроизводительным качествам на основе данных о генотипах по SNP-маркерам (исследование по признакам плодовитости, многоплодия, количества мертворожденных поросят и т. д.) является важным этапом для поиска потенциальных генов-маркеров. Для детального исследования их связи с хозяйственно полезными признаками удобными инструментами являются молекулярно-генетические тест-системы, которые разрабатываются специфически для анализа конкретного SNP, что позволяет изучить его полиморфизм, а также достоверные корреляции хотя бы с одним признаком. Такими потенциальными генами являются гены TNFα-индуцированного белка 3 (TNFAIP3) и CDP-диацилглицеролсинтазы 1 (CDS1). Результаты отечественных и зарубежных исследований показывают, что эти гены ассоциированы с регуляцией процесса катаболизма клеточных белков и дифференцировки жировых клеток.
Цель работы — разработка молекулярно-генетических тест-систем анализа полиморфизма генов TNFAIP3 и CDS1, применимых для исследования большого поголовья животных и проведения геномного отбора.
Материал и методы исследования
На первом этапе были проведены полногеномные ассоциативные исследования (GWAS) по 248 головам свиней у пород крупная белая (124 головы) и ландрас (124 головы). По полученным результатам был выполнен поиск SNP, ассоциированных с признаками воспроизводства, а именно многоплодия, количества мертворожденных и мумифицированных поросят. Для проведения дальнейшего исследования были выбраны два полиморфизма, показавшие достоверную (p < 0,00001) ассоциацию с признаками: толщина шпика над 6–7-м грудными позвонками и толщина шпика над 10–12-м грудными позвонками — в генах TNFAIP3 (SSC1, rs81351586, A/G) и CDS1 (SSC8, rs331818788, C/A). Определение полиморфизма осуществлялось методом ПЦР в реальном времени. Подбор олигонуклеотидных зондов и праймеров проводился исходя из локализации мутации с использованием онлайн-ресурса Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). Последовательности олигонуклеотидных праймеров и зондов указаны в таблице 1.
Для апробации полученных генов были использованы образцы ДНК 50 голов свиней породы крупная белая. Выделение ДНК производилось с использованием коммерческого набора «ДНК-Экстран-1» (ЗАО «Синтол», Россия) в соответствии с инструкцией производителей. ПЦР проводили в конечном объеме 19 мкл реакционной смеси, содержащей 1 × ПЦР буфера, 1 мМ MgCl2, 200 мкМ дНТФ, 20 пмоль каждого из праймеров и зондов, 1 Ед. Taq-полимеразы и 2 мкл ДНК.
Для проведения ПЦР использовали прибор Quant Studio 5 (Applied Biosystems). Реакции выполняли в следующем температурно-временном режиме: начальная денатурация 95 °С — 3 мин., 50 циклов амплификации в следующем температурно-временном режиме: 95 °С — 30 сек., 60 °С — 45 сек. Идентификация генотипов животных в режиме реального времени проводилась по характеру кривых флуоресценции.
Для проверки информативности разработанных ПЦР-РВ тест-систем были подобраны альтернативные пары праймеров для проведения последующего ПДРФ-анализа. Полученные ПДРФ-продукты разделяли в 3%-ном агарозном геле в присутствии бромида димидиума с последующей визуализацией в УФ-трансиллюминаторе. Для проведения амплификации были подобраны следующие праймеры: TNFAIP3 (5´-atctccaaagacatttccta-3´, 5´-tttcttaaataagcctcttgt-3´), CDS1 (5´-aacaccttttaaaactgcatac, 5´-gtagctttgtaatattgtttgaa-3´). Использованные эндонуклеазы рестрикции и длины фрагментов в зависимости от генотипов указаны в таблице 2.
Результаты и обсуждение
Разработанные тест-системы по потенциальным генам-маркерам продуктивности TNFAIP3 и CDS1 позволили четко определять генотипы животных в формате ПЦР-РТ (рис. 1) и ПЦР-ПДРФ (рис. 2).
Было установлено, что оба исследованных локуса являются полиморфными. Частоты встречаемости аллелей и генотипов генов TNFAIP3 и CDS1 показаны в таблице 3.
Выводы
На сегодняшний день в связи с развитием методов полногеномого секвенирования широкое распространение получили исследования однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) с помощью биочипов различной плотности. Следует отметить, что проведение генотипирования данным методом требует использования дорогостоящих секвенаторов и ДНК-чипов. Для массового скрининга животных по генам, ассоциированных с хозяйственно полезными признаками, удобно использовать простые и относительно недорогие тест-системы, основанные на методе полимеразной цепной реакции. Разработанные нами тест-системы, основанные на методах
ПЦР-ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) и ПЦР-РВ (ПЦР в реальном времени), показали высокую валидность при сравнении результатов генотипирования как между собой, так и с серией референтных образцов с известными генотипами, предварительно исследованных с помощью чипов GGP PorcineHD-24 Kit (Illumina).
Тем не менее следует отметить, что тест-системы на основе метода ПЦР-РТ имеют некоторые преимущества. Прежде всего это сокращение времени и себестоимости анализа за счет отсутствия необходимости проведения электрофореза и покупки дополнительных реактивов — эндонуклеаз рестрикции Vsp I иPsp6 I. Также тест-системы ПЦР-РТ отличаются более высокой точностью и позволяют минимизировать ошибки в интерпретации полученных результатов (рис. 2). Таким образом, разработанные нами тест-системы могут быть применены для исследования полиморфизма генов TNFAIP3 и CDS1 у свиней.
Ольга Сергеевна Романенкова, кандидат биологических наук, Федеральный исследовательский центр животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, пос. Дубровицы, 60, Московская обл., 142132, Российская Федерация
y7tteaip@mail.ru
https://orcid.org/0000-0002-2682-6164
Валерия Владимировна Волкова, кандидат биологических наук,старший научный сотрудник,Федеральный исследовательский центр животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста,пос. Дубровицы, 60, Московская обл., 142132, Российская Федерация
moonlit_elf@mail.ru
https://orcid.org/0000-0002-2080-0182
Анна Александровна Белоус, кандидат биологических наук,Федеральный исследовательский центр животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста,пос. Дубровицы, 60, Московская обл., 142132, Российская Федерация
abelous.vij@ya.ru
https://orcid.org/0000-0001-7533-4281
УДК 575.1, 636.03, 636.4 DOI: 10.32634/0869-8155-2023-368-3-58-61
Просмотров: 6Сельское хозяйство, ветеринария, зоотехния, агрономия, агроинженерия, пищевые технологии
