Разработка способа получения антигена аденовируса первой подгруппы аденовирусной инфекции крупного рогатого скота
Респираторные и желудочно-кишечные инфекции КРС остаются одной из актуальных проблем ветеринарии как в нашей стране, так и за рубежом.
Эти болезни, протекающие преимущественно в виде смешанных инфекций, широко распространены в современных крупных молочных и мясных скотоводческих комплексах.
Современными исследованиями доказано, что возбудителями вирусного энтерита и респираторных заболеваний КРС являются вирусы инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи, парагриппа-3, реовирусы и аденовирусы. При этом последние могут играть первостепенную роль в развитии патологического состояния скота.
Появляющиеся данные по выделению аденовирусов в биоматериалах и выявлению специфических антител к ним в сыворотках крови КРС свидетельствуют о потенциальном расширении ареала распространения аденовирусной инфекции на территории Российской Федерации. Тем не менее к настоящему времени отсутствуют четкие представления о нозогеографии аденовирусной инфекции КРС в хозяйствах нашей страны и не установлен наносимый ею экономический ущерб.
Одним из факторов, который осложняет диагностику аденовируса КРС, является большое количество его типов, обладающих генетическим разнообразием. В настоящий момент классифицированы 11 типов аденовируса КРС, принадлежащих родам Mastadenovirus (BAdV-1, BAdV-2, BAdV-3, BAdV-9 и BAdV-10) и Atadenovirus (BAdV-4, BAdV-5, BAdV-6, BAdV-7, BAdV-8 и BAdV-Rus). Для решения проблемы распространения аденовирусной инфекции КРС существенное внимание уделяется разработке новых, высокочувствительных и специфичных, простых в исполнении способов их диагностики.
Указанным требованиям отвечают методы с использованием иммуноферментных тест-систем, с помощью которых имеется возможность индицировать специфические антитела в сыворотке крови животных. Однако проблема создания диагностических наборов, содержащих антигенные компоненты аденовирусов различных подгрупп, остается нерешенной.
Создание иммуноферментных тест-систем требует концентрирования и очистки специфических биологических их компонентов, в том числе антигенов.
Получение антигенов высокой степени очистки, несомненно, имеет практическую значимость, в связи с тем что увеличивает чувствительность серологических реакций и, следовательно, эффективность лабораторной диагностики вирусной инфекции.
Разработка и совершенствование существующих методов получения высокоочищенных антигенных компонентов вируса аденовирусной инфекции представляют собой актуальную задачу ветеринарной медицины.
Цель данного исследования — разработка способа получения антигена аденовируса первой подгруппы аденовирусной инфекции КРС, выделенного из культуры клеток ВНК-21/13.
Материалы и методы исследования
Исследование проводили в лаборатории вирусологии отделения вирусологических и ультраструктурных исследований Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», Казань, Россия) в 2024 году.
Наработку культуральной суспензии штамма Adeno III WBR-1 аденовируса КРС осуществляли методом роллерного культивирования на перевиваемой культуре клеток ВНК-21/13. Для поддержания культуры клеток после заражения использовали среды 199 («ПанЭко», Россия), ГЛА (гидролизат лактальбумина) («ПанЭко», Россия) и «Игла MEM» с добавлением 1% L-глутамина и гентамицина («ПанЭко», Россия) в концентрации 50 мкг/мл.
В работе были использованы референтный штамм аденовируса КРС первой подгруппы (Adeno III WBR-1), полученный из государственной коллекции микроорганизмов ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». Клеточная линия почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21/13) получена из коллекции культур клеток и питательных сред отделения вирусологических и ультраструктурных исследований ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ».
Выделение вирусного антигена проводили методом ультразвуковой дезинтеграции остатков клеточного дебриса с помощью гомогенизатора Bandelin Sonopuls HD 3100 (Bandelin, Германия) при следующих режимах: продолжительность озвучивания — 120 с., интервал между импульсами — 60 с., частота колебаний — 22 кГц, температура — плюс 4 °С. Полученный гомогенат ресуспендировали 0,5 М фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ, pH 7,3), осаждали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 30 мин. и отбирали супернатант.
На второй стадии очистку антигена из полученного на предыдущем этапе супернатанта проводили путем осаждения белков аденовируса реагентом ПЭГ-6000 в конечной концентрации 8,0% при температуре +4 °С. Через 12 ч. получали осадок низкоскоростным центрифугированием при 9000 об/мин в течение 30 мин. и растворяли его в наименьшем объеме раствора 0,5 М ФСБ (pH 7,3). Полученный вирусный материал использовали для дальнейших этапов очистки аденовируса.
Далее очистку антигена аденовируса первой подгруппы осуществляли методом ультрацентрифугирования (УЦФ), применяя центрифугу Optima ХЕ-100 (Beckman Coulter, США), в градиенте хлористого цезия. Для формирования градиента плотности хлористого цезия в ультрацентрифужные пробирки (Beckman Coulter, США) последовательно добавляли равные объемы (по 3,0 мл) раствора хлористого цезия 10,0, 3,0 и 1,0 М. Поверх сформированного градиента наслаивали суспензию ПЭГ-осажденных антигенов (СПА) (4,0 мл), доводили объем до 15 мл 0,05 М фосфатно-солевым буфером (pH 7,2) (рис. 1). УЦФ осуществляли при 40 тыс. g и +4 °С в течение 3 ч.
Полученные белковые фракции подвергали исследованию с помощью электрофореза в 12,5%-ном полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях (SDS-PAGE) и иммуноблотинга с использованием гипериммунных (положительных) сывороток КРС для установления локализации полипептидов и их серологической активности.
На каждой стадии очистки антигена в полученных препаратах определяли концентрацию белка методом спектрофотометрии, используя прибор Multiskan Go (Thermo Fisher Scientific, США). Степень чистоты антигенных препаратов устанавливали аналитическим электрофорезом с применением вертикальной камеры Mini-Protean Tetra (Bio-Rad, США).
Иммунизацию опытных групп кроликов породы шиншилла (n = 3) массой 2,8–3,0 кг (из питомника ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ») проводили согласно следующей схеме: антигенные препараты в смеси с полным адъювантом Фрейнда вводили животным внутрикожно в пяти точках с двух сторон в области спины в концентрации 100 мкг/гол. Контролем служила группа животных (n = 3), которым вводили буферный раствор. На 45-е сутки у кроликов опытных и контрольной групп отбирали кровь для получения ее сыворотки.
Эксперименты с животными осуществляли строго, соблюдая требования ГОСТ 33215-2014 и Директиву ЕС 2010/63/EU.
Установление антител к полученным антигенным препаратам аденовируса первой подгруппы осуществляли в сыворотках крови кроликов непрямым вариантом иммуноферментного анализа (ИФА), как описано авторами ранее. Планшеты для ИФА сенсибилизировали антигенными препаратами в концентрации 10 мкг/мл в течение 12 ч. при +4 оС. Образцы сывороток животных использовали в последовательных двукратных разведениях, начиная с 1:200. Измерение светопоглощения осуществляли фотометром Bio-Rad 680 (Bio-Rad, США) при длине волны 450 нм. Титр антител рассчитывали по величине разведения сыворотки при условии, что значение оптической плотности исследуемого образца в 2 раза превышает контрольное.
Статистический анализ полученных результатов исследования осуществляли в программах MS Excel (США) и GraphPad Prism (США), применяя дисперсионный анализ (one-way ANOVA) и критерий Тьюки, и с помощью t-критерия Стьюдента. Достоверными считали данные с уровнем значимости p < 0,05.
Результаты и обсуждение
Основными требованиями, которые предъявляют к получаемым для диагностических наборов антигенам, являются качество последних (степень чистоты, серологическая активность, специфичность, способность связываться на поверхности твердофазного полистирола), а также сохранение указанных свойств при длительном хранении.
Методы выделения и очистки антигенных препаратов характеризуются рядом специфических особенностей, которые в основном обусловлены крайней неустойчивостью молекулы антигена и потерей вышеуказанных свойств под воздействием различных факторов внешней среды. В связи с этим при выделении и очистке препаратов антигенов необходим индивидуальный подход, позволяющий повышать выход белка при одновременном уменьшении количества этапов очистки. В большинстве случаев антигены выделяют и очищают, используя мощные комбинации различных приемов осаждения и методов разделения.
В исследованиях авторов схема получения антигена аденовируса КРС первой подгруппы включала несколько этапов: приготовление матровой расплодки аденовируса КРС на перевиваемой клеточной линии ВНK-21/13; наработку вирусной биомассы методом роллерного культивирования; разрушение инфицированных клеток ультразвуком и освобождение от клеточных фрагментов с помощью центрифугирования; осаждение антигена с применением ПЭГ-6000, концентрирование вируса через ступенчатый градиент хлористого цезия путем УЦФ; сбор целевых фракций (рис. 2).
Применение роллерной технологии культивирования аденовируса позволило получить вирусную массу с инфекционной активностью 4,75±0,03 lg ТЦД50/мл. В раннем исследовании авторов выявлено преимущество указанной технологии для получения более высокого выхода вирусных частиц по сравнению с технологией стационарного культивирования.
После разрушения инфицированных клеток ультразвуком в полученном клеточном супернатанте концентрация белка составила 0,72±0,01 мг/мл (рис. 4). Потеря содержания белка на этапе осаждения протеинов с применением ПЭГ-6000 составила 53,1%. Данный метод позволяет антигенный осадок без дополнительных стадий переводить в раствор используемого в исследовании буфера и использовать для дальнейших этапов очистки.
На следующем этапе получения антигена аденовируса КРС первой подгруппы авторами был применен метод фракционирования ПЭГ-осажденного препарата в ступенчатом градиенте плотности хлористого цезия. В результате исследований получены три основные антигенные фракции (препараты) (рис. 3), каждая из которых была отобрана для исследования с помощью аналитического электрофореза, в реакциях вестерн-блоттинга и ИФА.
Определение чистоты препаратов методом вертикального электрофореза в ПААГ показало, что после УЦФ во всех исследованных образцах обнаруживались полипептиды с молекулярной массой от 35,0 до 50,0 кДа. Необходимо отметить, что на электрофореграммах выявлялись дополнительные белковые полосы, свидетельствуя о наличии балластных белков.
Посредством иммуноблоттинга с использованием гипериммунных сывороток КРС были установлены активность и специфичность белковых фракций аденовируса (рис. 5, 6).
Исходя из распределения антигенных фракций, можно заключить, что большая часть материала распределена в области с молекулярной массой 50,0 и 45,0 кДа. Полученные авторами препараты с указанным молекулярным весом, вероятно, относятся к протеинам IVa2, E1B-420R или pV, способным к участию в процессе патогенеза аденовирусной инфекции. Дальнейшие исследования протективного потенциала выявленных антигенов открывают перспективы применения последних в качестве компонентов различных типов вакцин и тест-системы ИФА для диагностики аденовирусной инфекции КРС.
Активность и специфичность антигенных препаратов установлены непрямым вариантом ИФА с использованием контрольных (К+ (положительной) и К— (отрицательной) сывороток КРС (табл.).
Серологическую активность проявили все полученные антигенные препараты. При этом значения ОП450 для препаратов № 1–3 при разведении сыворотки К+ 1:200 составили, соответственно, 1,271±0,030 ОЕ (К+/К— = 9,08), 0,996±0,024 ОЕ (К+/К— = 6,47) и 1,453±0,035 ОЕ (К+/К— = 2,63). Следовательно, наиболее перспективным для использования в качестве антигенного компонента тест-системы ИФА для серологической диагностики аденовирусной инфекции КРС являлся препарат № 1.
Для получения препаратов иммуноглобулинов авторами осуществлена оценка возможности использования очищенных антигенных препаратов аденовируса первой подгруппы в качестве иммунизирующих агентов (рис. 7).
При исследовании сывороток крови кроликов на 45-е сутки после введения антигенных препаратов был установлен прирост титров специфических антител на уровне 1:400–1:3200.
Антигенная специфичность очищенного авторами аденовирусного протеина и возможность применения последнего как иммунизирующего агента подтверждают эффективность предложенного способа получения антигена аденовируса КРС первой подгруппы.
Разработанный способ получения антигена может быть использован для получения антигенных препаратов вирусов — возбудителей, опасных для сельскохозяйственных животных инфекций.
Выводы
Предложенный авторами способ получения антигена аденовируса КРС первой подгруппы, который включает приготовление матровой расплодки вируса на перевиваемой клеточной линии ВНK-21/13, наработку вирусной биомассы методом роллерного культивирования, разрушение инфицированных клеток ультразвуком и освобождение от клеточных фрагментов центрифугированием, осаждение антигена с применением ПЭГ-6000 и концентрирование последнего через ступенчатый градиент хлористого цезия путем УЦФ, позволил получить очищенный препарат, содержащий протеин с молекулярной массой 50,0 кДа и проявляющий высокую антигенную активность.
Дальнейшие исследования открывают перспективы применения очищенного антигена аденовируса для конструирования тест-системы ИФА с целью серологической диагностики аденовирусной инфекции КРС.
Об авторах
Айнур Ильнурович Яруллин, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник
abii@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-1717-0498
Ришат Салаватович Мухаммадиев, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
tashir9891@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-7812-9168
Ринат Салаватович Мухаммадиев, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
tanirtashir@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-2524-9609
Ильсияр Габделгазизовна Каримуллина, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
89047699225@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-6771-3457
Диана Анатольевна Сорокина, младший научный сотрудник
diana-sorokina2013@mail.ru https://orcid.org/0009-0006-5339-5175
Вали Галиевич Гумеров, доктор ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник
gumerowali@mail.ru https://orcid.org/0000-0001-5878-4299
Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности, Научный городок — 2, Казань, 420075, Россия
УДК 578.826.2
DOI: 10.32634/0869-8155-2025-399-10-17-24
Просмотров: 139
