Разработка системы анализа участка митохондриального генома (Cyt B) из образцов крупного рогатого скота разных временных периодов
Согласно отчету FAO, всего в мире зарегистрированы 8859 пород животных и птицы, в том числе 7739 — локальных (то есть зарегистрированных только в одной стране). В настоящее время около 600 пород классифицируются как вымершие.
Угроза биоразнообразию возрастает в связи с потерей генетического разнообразия видов, используемых в сельском хозяйстве. В связи с тем что за последние десятилетия животноводство было нацелено на использование ограниченного количества высокопродуктивных пород крупного рогатого скота, это привело к заметному уменьшению многообразия и численности местного скота не только в России, но и во всем мире. По большей части игнорируются генетические ресурсы пород, адаптированных к местным условиям, с их уникальными характеристиками.
Отсутствие достаточной информации о ресурсах локальных пород, включая их нынешнее генетическое разнообразие и уровень инбридинга, приводит к трудностям в разработке эффективных стратегий сохранения.
Среди многочисленных доступных молекулярных маркеров митохондриальная ДНК (мтДНК) широко используется для изучения генетического разнообразия и анализа филогенетических связей у различных пород и популяций сельскохозяйственных животных.
Искусственное осеменение, получившее широкое распространение во второй половине ХХ века, а также массовое использование коммерческих пород для улучшения локальных привели к резкому снижению генетического разнообразия и значительным изменениям генофонда пород. Поэтому проведение филогенетических исследований подразумевает вовлечение в исследование исторических образцов ДНК, полученных из костного порошка черепов и других скелетных элементов (зубы, рога и т. д.), хранящихся в музейных коллекциях или полученных в ходе археологических исследований. При этом работа с данными образцами сопряжена с рядом сложностей, одной из которых является подготовка к депонированию, включающая ряд агрессивных химических воздействий, что приводит к существенной деградации нуклеиновых кислот, в связи с чем получение достаточного количества ядерной ДНК не всегда возможно, в отличие от митохондриальной, количество копий которой в одной клетке от 100 до 1000.
Митохондриальный геном крупного рогатого скота представляет собой кольцевую молекулу, состоящую примерно из 16,4 тыс. п. о., и функционально делится на регуляторный, некодирующий и кодирующий регионы. В состав мтДНК входят 37 генов (13 — для белков дыхательной цепи, 22 — для тРНК, 2 — для рРНК) и 1 некодирующая область — D-петля.
МтДНК характеризуется такими замечательными свойствами, как материнское наследование, большое число копий и высокая скорость мутаций без рекомбинации. Высокое количество копий мтДНК по сравнению с ядерной ДНК делает ее идеальным инструментом для анализа сильно деградированной ДНК.
Цитохром b (Cyt B) представляет собой ген мтДНК, который широко используется для определения филогенетических связей у домашних животных из-за вариабельности его последовательностей. Полное секвенирование гена Cyt B — это трудоемкий и кропотливый процесс из-за его размера (около 1140 п. о.). Более того, Cyt B относится к белок-кодирующим генам, который имеет обширную филогенетическую информацию внутривидового и межвидового характера и более высокий коэффициент вариаций по сравнению с другими функциональными генами. Следовательно, мтДНК Cyt B играет огромную роль в определении генетического разнообразия и филогенетических взаимоотношений.
Цель работы — разработка тест-системы, позволяющая получить полную последовательность гена Cyt B для дальнейшей оценки генетического разнообразия и филогенетических связей различных пород и популяций крупного рогатого скота.
Материалы и методы исследования
В качестве биологического материала для выделения ДНК был использован костный порошок, полученный из фрагментов костей, предварительно очищенных от механических примесей, обработанных детергентом и ультрафиолетовым облучением для предотвращения контаминации экзогенной ДНК. Данные образцы крупного рогатого скота, содержащегося на территории средневекового Ярославля (XIII–XIV вв.) (n = 10), были получены из биоколлекции Института археологии РАН.
Исследование проводили в 2024 году на базе Центра коллективного пользования «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр животноводства» — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста.
ДНК выделяли с использованием набора COrDIS «Экстракт» (ООО «Гордиз», Россия) Декальцин в соответствии с рекомендациями производителя. Для амплификации гена Cyt B (Цитохром b) мтДНК КРС были подобраны четыре пары праймеров, перекрывающих друг друга, общей длины 1189 п. н. между позициями 14480–15669 мтДНК, что позволяет амплифицировать полную последовательность гена Cyt B (Цитохром b) КРС между позициями 14514–15653 мтДНК.
Праймеры были подобраны в соответствии с референсной последовательностью мтДНК КРС, представленной в базе Национального центра биотехнологической информации NCBI (GenBank: NC_006853.1) с помощью онлайн-ресурса Basic (табл. 1).
ПЦР-амплификацию проводили на термоциклере Applied Biosystems SimpliAmp (Thermo-Fisher Scientific, Inc., США) в конечном объеме 25 мкл, в том числе 2,5 мкл реакционного буфера (10X Taq Turbo буфер) («Евроген», Россия), 16,8 мкл H2O, 2,5 мкл dNTPs, 1 мкл смеси праймеров 10 пмоль, 0,2 мкл SmartTaq ДНК полимеразы («Диалат Лтд.», Россия), 1 мкл ДНК.
Условия температурно-временного режима ПЦР были следующими: начальная денатурация (94 °С в течение 3 мин.); 94 °С в течение 10 сек., 64 °С в течение 15 сек., 72 °С в течение 45 сек. (40 циклов); заключительная элонгация (72 °С в течение 7 мин.).
Очистку ампликонов проводили с использованием набора для очистки ДНК из реакционной смеси и агарозного геля Cleanup-Mini («Евроген», Россия).
Последовательности ДНК определяли секвенированием по Сэнгеру на генетическом анализаторе «Нанофор 05» (ООО НПФ «Синтол», Россия) с использованием набора GenSeq (ООО «НПФ “Синтол”», Россия) согласно инструкциям производителя.
Выравнивания результатов секвенирования проводили на основе полной последовательности мтДНК (GenBank: NC_006853.1) с использованием программ BioEdit 7.2.
Расчеты и построение филогенетической дерева осуществляли методом максимального правдоподобия в программе MEGA X (www.megasoftware.net).
Для определения принадлежности исследуемых образцов КРС к известным гаплогруппам из базы NCBI были отобраны последовательности мтДНК крупного рогатого скота, относящиеся к гаплогруппам Т1, Т2, Т3, Т4, Т5, Q, R, P, I и C (табл. 2).
Результаты и обсуждение
Для определения наилучшего условия температурного режима отжига праймеров проводили градиентный ПЦР. Детекцию результатов ПЦР выполняли в 1%-ном агарозном геле с использованием колориметрической системы документации на геле Uvitec FireReader V10 imaging System (Cleaver scientific, Великобритания) (рис. 1–3).
Результаты секвенирования ампликонов, полученных из четырех пар праймеров, были выровнены на основе референсной последовательности GenBank: NC_006853.1 и соединены между собой (рис. 4–8).
Общая длина нуклеотидной последовательности при сборке составила 1194 п. н., расположенной между позициями 14505–15699 мтДНК КРС, что позволило получить полную последовательность гена Cyt B (Цитохром b) мтДНК КРС между позициями 14514–15653.
Анализ филогенетического дерева (рис. 8), построенного методом ML (максимального правдоподобия), выявил, что все исследуемые образцы были сгруппированы с представителями гаплогрупп Т1, T2, T3 и T5.
Как видно из рисунка 10, медианная сеть, построенная на основании последовательностей Cyt B, позволяет уверенно отнести археологические образцы к Bos Taurus, а не к Bos Indicus.
Выводы
Разработанная авторами тест-система на основе 4 пар праймеров позволила получить из археологических образцов полные последовательности гена Cyt B (Цитохром Б)мтДНК крупного рогатого скота рода Bos taurus. Мощности анализа по последовательности Cyt B недостаточно, чтобы разделить гаплогруппы внутри тауринного скота, в связи с тем что последовательность цитохрома b более консервативна по сравнению с другими участками митохондриального генома. Тем не менее можно говорить, что археологические образцы не отличаются по последовательности Cyt B от гаплогрупп Т1, Т1а, Т3 и Т5. Для уверенной идентификации гаплогрупповой принадлежности следует использовать более полиморфные области митохондриального генома, например последовательность D-петли.
Об авторах
Маргарет Сержевна Форнара; кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
margaretfornara@gmail.com; https://orcid.org/0000-0002-8844-177X
Александра Сергеевна Абдельманова; доктор биологических наук, старший научный сотрудник
abdelmanova@vij.ru; https://orcid.org/0000-0003-4752-0727
Некруз Фарходович Бакоев; кандидат сельскохозяйственных наук, научный сотрудник
nekruz82@bk.ru; https://orcid.org/0000-0002-0324-3580
Наталия Анатольевна Зиновьева; доктор биологических наук, академик РАН, директор
n_zinovieva@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-4017-6863
Федеральный исследовательский центр животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, пос. Дубровицы, 60, Подольский р-н, Московская обл., 142132, Россия
УДК 636.2.082.13
DOI: 10.32634/0869-8155-2024-388-11-75-81
