Применение методов insilico при направленном гидролизе сывороточных белков
Пищевые отходы благодаря своей органической природе и массовому производству обладают большим потенциалом для вторичной переработки. Однако они требуют новых подходов к управлению и переработке. Внимание мирового сообщества к проблеме переработки малоценного сельскохозяйственного сырья, непищевых органических отходов и пищевых отходов резко возросло, что усугубляется экономическим развитием и увеличением численности населения. Перенаселение, миграция людей в городские районы, развитие и экспансия городов привели к увеличению потребления продуктов питания, в том числе с заданными характеристиками (повышенными потребительскими свойствами), и, следовательно, к увеличению количества различных видов отходов, в том числе пищевых.
Согласно Федеральному классификационному каталогу отходов, основными отходами молочной промышленности являются пахта, обезжиренное молоко, молочная сыворотка. В настоящее время лишь четверть произведенной молочной сыворотки направляется на промышленную обработку. Большая часть ее, к сожалению, утекает в канализационную систему, приводя к загрязнению природных вод. Молочное производство в России обладает значительными запасами сыворотки, что подчеркивает необходимость разработки новых технологий и методов ее использования.
Сыворотка — это источник сывороточных белков, богатый минералами, витаминами и другими полезными веществами. Кроме того, исследования показывают, что сывороточные белки обладают защитной антиоксидантной активностью.
Первоначально молочную сыворотку рассматривали как загрязняющий элемент, восприятие ее изменилось после того, как были раскрыты ее многочисленные полезные и биологически активные характеристики. Под воздействием ферментативного катализа получают белковые гидролизаты сыворотки, которые обладают рядом уникальных функций, обусловленных присутствием биологически активных пептидов.
Биоактивные пептиды — это фрагменты белка, которые полезны для систем организма и здоровья человека в целом. Большинство биоактивных пептидов имеют молекулярную массу от двух (дипептидов) до 20 аминокислотных остатков и молекулярную массу до 6000 Да. Биоактивные пептиды обладают рядом важных функций, таких как антиоксидантное, противовоспалительное, противоопухолевое, противомикробное и иммуномодулирующее действие в живом организме.
Для получения биоактивных пептидов они должны быть высвобождены из исходного белка, в состав которого входят и находятся в неактивной форме. Существуют различные методы, которые отвечают за выполнение этого действия посредством специфических механизмов, влияющих на состав, последовательность и длину аминокислот, входящих в состав пептида, вызывая изменение биологической активности в соответствии с используемым методом.
Многочисленные исследования показали, что биологическая активность пептидов связана с улучшением общего состояния здоровья и снижением риска определенных хронических заболеваний, таких как рак, диабет и болезни сердца.
В настоящее время одним из методов теоретического прогнозирования активности ферментов является использование молекулярного моделирования для изучения взаимодействия ферментов с субстратами. Для проведения таких исследований в виртуальной среде in silico применяются трехмерные структуры белков.
Использование компьютерного моделирования позволяет значительно сократить время, необходимое для обнаружения потенциальных биологических эффектов новых модификаций различных органических соединений.
Одно из направлений исследований, касающихся биоактивных пептидов, связано с использованием инструментов in silico для их анализа.
Методы in silico
1) Метод ADMET, который является инструментальным методом прогнозирования, базируется на создании обширных баз данных о существующих лекарственных веществах. Это уменьшает риски на последующих этапах испытаний и ускоряет процесс поиска благодаря прогнозированию на основе имеющихся данных. Данный метод помогает прогнозировать информацию об оптимальной дозе активной фармацевтической субстанции, частоте применения, наиболее эффективном способе введения, биодоступности, выведении, метаболизме и других характеристиках.
2) Молекулярное моделирование представляет собой метод, который показывает, как лекарственные препараты и другие химические вещества взаимодействуют с рецепторами клеток.
3) Моделирование целостной клетки: исследователи создали компьютерную модель переполненной внутренней части бактериальной клетки, которая в тестах по реакции на сахар в окружающей среде с точностью имитирует поведение настоящих клеток.
Инструменты in silico включают, например, базы данных белковых и пептидных последовательностей, программы для прогнозирования физико-химических свойств пептида и его биологической активности и программы, позволяющие осуществлять теоретический гидролиз белка с целью получения пептидов.
Технологии биоинформатики достаточно часто используются для изучения биологически активных пептидов, полученных из белков пищевых продуктов. Это возможно благодаря предоставленной информации о конформации, потенциальной активности, механизмах молекулярного воздействия и функциональных свойств пептида.
Наиболее распространенные базы данных и инструменты биоинформатики для анализа биоактивных пептидов in silico представлены в таблице 1.
Основные этапы применения подходов in silico представлены на рисунке 1.
Цель работы — анализ воздействия ферментов на биотехнологические свойства белков молочной сыворотки методом in silico с использованием базы данных BIOPEP-UWM.
Методы и материалы
Объектами исследований методом in silico являлись сывороточные белки β-лактоглобулин и α-лактальбумин. Для анализа воздействия ферментов на биотехнологические свойства сывороточных белков использовалась база данных BIOPEP-UWM. Методология работы c базой данных BIOPEP-UWM представлена на рисунке 2.
Для выбора ферментов использовалась база данных Peptide Cutter. Peptide Cutter предсказывает потенциальные места расщепления протеазами или химическими веществами в данной последовательности белка.
Для работы с базами данных соответствующие последовательности аминокислот для β-лактоглобулина и α-лактальбумина были загружены из базы данных белков UniProtKB или InterPro.
При помощи базы данных BIOPEP-UWM можно рассчитать биологическую активность высвобожденных пептидов, а именно теоретическую степень гидролиза (DHt), частоту высвобождения фрагментов с заданной активностью выбранными ферментами (AE) и относительную частоту высвобождения фрагментов с заданной активностью выбранными ферментами (W).
Расчет проводится базой данных по формулам (1) и (2):
AE = d / N (1)
W = AE /A, (2)
где: d — количество фрагментов, высвобождаемых ферментами с заданной активностью из данной белковой последовательности; N — общее количество аминокислотных остатков в белковой цепи; A — частота встречаемости биологически активных фрагментов в белковой последовательности [25].
Результаты исследования База данных в соответствии с запросом выводит список ферментов, которые расщепляют указанную аминокислотную последовательность, указывает количество расщеплений и их участки (рис. 3) и выводит список ферментов, которые не расщепляют последовательность (рис. 4).
Для последующего анализа из представленных расщепляющих ферментов были выбраны с наибольшим количеством расщеплений: протеиназа K, термолизин, пепсин (pH 1.3), пепсин (pH > 2), трипсин, химотрипсин A, химотрипсин С.
Результаты действия ферментов на β-лактоглобулин и α-лактальбумин, а также активность этих ферментов, приведены в таблицах 2, 3.
Теоретическая степень гидролиза, частота высвобождения фрагментов с заданной активностью выбранными ферментами и относительная частота высвобождения фрагментов с заданной активностью выбранными ферментами для α-лактальбумина представлены в таблице 4, для β-лактоглобулина — в таблице 5.
Все данные, полученные из базы данных BIOPEP-UWM, необходимы для создания собственной базы данных, на основе которой планируется разработка программы для поддержки принятия решений, то есть для выбора необходимого фермента для расщепления белков α-лактальбумина и β-лактоглобулина с получением активных пептидов.
Выводы
Результаты работы показали, что применение методов in silico позволяет быстро установить целесообразность ферментации сывороточных белков тем или иным ферментом, а также выявить возможные биоактивные пептиды при направленном гидролизе белков. Современные базы данных белков и пептидов значительно повышают эффективность проведения исследований в области получения биоактивных пептидов с определенной активностью.
Об авторах
Илья Михайлович Чанов; студент
https://orcid.org/0000-0001-7484-3252; chanovi2000@mail.ru
Южно-Уральский государственный университет, пр. им. Ленина, 76, Челябинск, 454080, Россия
УДК 637.04
DOI: 10.32634/0869-8155-2024-384-7-170-178
