Оптимизация углеводного питания для сохранения генетических ресурсов винограда в системе invitro
В связи с изменением климата, техногенными катастрофами, урбанизацией, сокращением возделываемых площадей исчезают или стоят на грани исчезновения редкие автохтонные и селекционные сорта винограда. Полевые коллекции занимают значительные площади и требуют значительных затрат на проведение агротехнических операций. Становится актуальным создание коллекций культурных растений, культивируемых в контролируемых условиях in vitro.
Использование методов in vitro для сохранения и поддержания генофонда винограда имеет некоторые преимущества. Значительно уменьшаются потребности в площади, экономятся ресурсы, снижаются производственные затраты.
В институте «Магарач» создана «Вегетирующая коллекция растений in vitro перспективных сортов, гибридов и клонов винограда». Основную часть коллекции составляют растения автохтонных крымских сортов и селекционных сортов института «Магарач». Разработаны режимы для поддержания образцов вегетирующей коллекции в условиях активного и замедленного роста и в условиях глубокого покоя.
Методики, обеспечивающие медленный рост, основаны на снижении температуры и освещенности, модификации среды, добавления веществ ингибирующего действия.
Углеводы — незаменимые компоненты для культивирования изолированных клеток и тканей, так как в большинстве случаев последние не способны к автотрофному питанию. Чаще всего в качестве источника углеводов используют сахарозу или глюкозу в концентрациях 20–40 г на 1 л раствора.
Сахароза — основной энергетический материал растений, образующийся в процессе фотосинтеза. Повышенная концентрация сахарозы в питательной среде задерживает рост клеток, не вызывая токсического эффекта, поэтому может быть использована для поддержания культур в состоянии покоя в течение длительного периода. Кроме того, высокий уровень сахарозы (аналогично действию пролина) обеспечивает растительным клеткам возможность без повреждения переносить температуру ниже 0 ºС.
Актуальными являются исследования по изучению возможности использования питательных сред как с повышенной концентрацией сахарозы, так и без содержания данного вещества для культивирования растений винограда в вегетирующих коллекциях in vitro.
Авторами установлено, что предельная для сохранения гармоничного роста морфогенных структур растений винограда in vitro концентрация сахарозы в среде культивирования составляет 60 г/л.
Цель исследования — оптимизирование углеводного питания растений для поддержания образцов коллекции в условиях замедленного роста и состояния глубокого покоя.
Материалы и методы
Исследования проведены в лаборатории генетики, биотехнологий селекции и размножения винограда Всероссийского национального научно-исследовательского института виноградарства и виноделия «Магарач» РАН в 2022–2023 гг.
Материалом для исследования служили растения винограда технических сортов селекции института «Магарач» Антей магарачский, Гранатовый Магарача, Памяти Голодриги, культивируемые в условиях in vitrо. В процессе исследований использовали методы, разработанные в институте «Магарач».
Культивирование проводили на среде PG (Plant growth, 1995 г.). В исследовании использовали три варианта среды: без сахарозы, 10 г/л (контроль), 60 г/л. В стерильных условиях растения in vitro черенковали на двухглазковые экспланты и высаживали в пробирки диаметром 20 мм на питательные среды.
Культивирование растений осуществляли на свету при 16-часовом фотопериоде интенсивностью 1000 люкс и температуре +25–27 оС.
Растения анализировали по морфометрическим показателям (длина побега, количество корней и междоузлий), приживаемость и вызревание побега — через 4 и 10 месяцев после начала культивирования.
Статистическую обработку данных осуществляли с помощью программы Microsoft Excel (США).
Различия между вариантами считали статистически значимыми при уровне достоверности p ≤ 0,05.
Результаты и обсуждение
Приживаемость по всем средам 100% была только у эксплантов сорта Памяти Голодриги. Анализ развития морфологических структур через 4 месяца культивирования показал, что морфометрические показатели экспериментальных растений были ниже, чем у контроля, при этом сохранялся гармоничный рост осевых органов (табл. 1).
Показатель длина корня по всем сортам был выше на среде без сахарозы. Для растений сортов Антей магарачский и Гранатовый Магарача на контрольной среде показатели «длина побега» и «количество междоузлий» были выше, чем на опытных средах (рис. 1). Это указывает на замедление ростовых процессов, что важно для сохранения растительного материала.
Показатель «вызревание лозы» у растений, культивированных на среде с сахарозой 60 мг/л, варьировал по сортам. Иная картина по определяемым показателям у растений сорта Памяти Голодриги. Показатель «длина побега» выше на среде без сахарозы, что при меньшем количестве междоузлий (по сравнению с контролем) указывает на рост побега за счет растяжения (рис. 1, 2).
Выявлена сортовая специфичность по наличию хлорофилла в листьях у растений, предназначенных для сохранения на свету при пониженном освещении и по степени вызревания побега у растений, в будущем сохраняемых при низких положительных температурах в темноте (рис. 3).
У растений сорта Гранатовый Магарача были отмечены низкая приживаемость эксплантов на среде без сахарозы и частичное отсутствие хлорофилла в листьях, что не было характерным для других сортов.
Через 10 месяцев культивирования (рис. 4) провели анализ развития морфологических структур по показателям «длина побега», «количество междоузлий» (рис. 5).
Растения всех сортов на среде без сахарозы при заданных условиях продолжали развиваться и по показателям «длина побега» и «количество междоузлий» превышали контроль. По показателю «количество междоузлий» растения всех сортов на среде с сахарозой в концентрации 60 мг/л превышали контроль (рис. 6).
Можно заключить, что на среде с сахарозой 60 мг/л морфогенез побега проходил за счет верхушечного роста. При повышенной концентрации сахарозы побег полностью одревеснел, проявилась осенняя окраска листьев, при этом признаков увядания не наблюдалось.
Таким образом, растения винограда при длительном культивировании in vitro на средах без сахарозы, с сахарозой 10 мг/л и 60 мг/л сохраняют жизнеспособность, при этом показатель «длина побега» у растений выше на среде без сахарозы. Видимо, фотосинтез листового аппарата достаточно обеспечивает энергией для гармоничного роста, что в данном случае ограничивает период беспересадочного поддержания растенийin vitro.
Выводы
Установлено, что по всем исследуемым в эксперименте сортам (Антей магарачский, Гранатовый Магарача, Памяти Голодриги) на среде 60 мг/л сохраняется гармоничный рост, наблюдается одревеснение лозы, что может благоприятно влиять на сохранение образцов при пониженной положительной температуре.
Для поддержания образцов коллекции может быть использован комбинированный режим, состоящий из двух этапов культивирования: первый — свет интенсивностью 1000 лк в условиях 16-часового фотопериода при температуре +25–27 оС, продолжительность периода — до полного одревеснения побега; второй — при низких положительных температурах +2–4 в темноте.
Продолжительность беспересадочного сохранения в комбинированном режиме зависит от генетической специфичности конкретного сорта, физиологического состояния растения и условий культивирования.
Об авторах
Ирина Александровна Павлова; кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории биотехнологий селекции и размножения винограда
pavlovairina1965@gmail.com; 0000-0003-0818-8215
Тел. +7 (978) 762-03-50
Екатерина Александровна Лущай; младший научный сотрудник, лаборатории биотехнологий селекции и размножения винограда
lea_rs@mail.ru; 0000-0002-5695-5936
Анифе Смаиловна Абдурашитова; младший научный сотрудник лаборатории биотехнологий селекции и размножения винограда
abdurashitova97@inbox.ru; 0000-0003-2419-6477
Виктор Павлович Клименко; доктор сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник лаборатории биотехнологий селекции и размножения винограда
vikklim@magarach-institut.ru; 0000-0002-7452-0776
Мария Игоревна Григоренко; младший научный сотрудник лаборатории биотехнологий селекции и размножения винограда
grigorenkomary17@gmail.com; 0000-0002-8565-0082
Всероссийский национальный научно-исследовательский институт виноградарства и виноделия «Магарач» Российской академии наук, ул. им. Кирова, 31, Ялта, 298600, Россия
УДК 634.8:57.083.13/.085.2
DOI: 10.32634/0869-8155-2024-388-11-104-108
