Оценка генетического разнообразия линий подсолнечника селекции ВНИИМК на основе мультиплексного микросателлитного анализа
Подсолнечник (Helianthus annuus L.) входит в список основных масличных культур Российской Федерации. Содержание масла в его семенах достигает 60% и составляет 90% сырья, перерабатываемого масложировой промышленностью. Подсолнечное масло отличается высокими вкусовыми качествами и используется непосредственно в пищевой промышленности. Жмых и шрот, обмолоченные корзинки, являются ценным источником корма для скота. Данная сельскохозяйственная культура обеспечивает не только внутреннее потребление, но и занимает второе место по экспорту масличного сырья, уступая сое. Показатель экспорта подсолнечного масла за 2023 год составил 67,5%.
В Федеральном научном центре «Всероссийский научно-исследовательский институт масличных культур им. В.С. Пустовойта (ВНИИМК)» селекция подсолнечника осуществляется уже более 100 лет. Становление подсолнечника как масличной культуры, нашедшей широкое распространение сначала в нашей стране, а затем и во многих странах мира, связано с именем выдающегося ученого-селекционера В.С. Пустовойта. Фактически под его руководством создана новая техническая культура, пригодная для промышленного производства.
Селекционерами ВНИИМК созданы сорта и гибриды подсолнечника разных групп спелости с высокой продуктивностью, обладающие устойчивостью к биотическим и абиотическим стрессорам. Успешно ведется работа по селекции данной культуры на крупноплодность, устойчивость к гербицидам, изменение жирнокислотного состава масла семян.
Ряд сортов, созданных селекционерами (ВНИИМК 1646, ВНИИМК 6540, Армавирский 3497, ВНИИМК 8883, Передовик, Смена, ВНИИМК 8931, Первенец и др.), распространились по всему миру, включая свою историческую родину — Северную Америку, и служат источниками таких важных хозяйственно ценных признаков, как высокая масличность, высокая продуктивность, низкая лузжистость, высокое содержание олеиновой кислоты в масле семян, устойчивость к патогенам.
ВНИИМК ведет селекционные программы подсолнечника, адаптированного к выращиванию в разных регионах, на трех основных опытных станциях: Центральная экспериментальная база (ЦЭБ) ВНИИМК, г. Краснодар, Россия; Армавирская опытная станция (АОС) ВНИИМК, г. Армавир, Краснодарский край, Россия; Донская опытная станция (ДОС) ВНИИМК, пос. Опорный, Ростовская обл., Россия.
Накоплен значительный исходный селекционный материал подсолнечника, куда вошли, кроме сортов, коммерческие линии и гибриды, образцы, являющиеся донорами хозяйственно ценных признаков.
За 2022 год доля высеянных семян подсолнечника отечественной селекции составила всего 22%. Существует потребность увеличения темпов импортозамещения и обеспечения продовольственной безопасности России. Создание качественных, высокопродуктивных сортов и гибридов предполагает большие материальные затраты и длительность процесса. В связи с этим для развития отечественных селекционных программ и увеличения эффективности селекционного процесса необходимо привлечение современных технологий генотипирования, обеспечивающих изучение генетического разнообразия и идентификацию селекционного материала. Для этих целей наиболее эффективным и распространенным инструментом являются микросателлитные ДНК-маркеры (SSR, Simple Sequence Repeats) — простые тандемные повторы фрагментов ДНК.
На протяжении нескольких десятков лет в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Федеральный научный центр “Всероссийский научно-исследовательский институт масличных культур им. В.С. Пустовойта”» изучалось молекулярно-генетическое разнообразие генотипов подсолнечника отечественной и иностранной селекции. Основным методом исследования являлась идентификация генотипов с помощью микросателлитных локусов ДНК. Однако генотипирование 54 линий подсолнечника коллекции ВНИИМК с помощью 12 SSR маркеров выявило лишь их умеренное генетическое разнообразие, хотя охарактеризованные при помощи других типов маркеров 186 линий селекции ВНИИМК показали значительную гетерогенность.
Использованные SSR-маркеры не позволили оценить всё генетическое разнообразие изучаемой коллекции линий, поскольку не все из них обладали достаточной информативностью. Следует иметь в виду, что значительно ускоряет и удешевляет процесс генотипирования растений мультиплексный анализ микросателлитных локусов, при котором разные SSR-праймеры помещаются в одну и ту же реакционную смесь. Для разработки эффективной системы идентификации подсолнечника был осуществлен поиск более информативных микросателлитных маркеров из опубликованных литературных источников. Приемлемыми для генотипирования подсолнечника оказались только три локуса (ORS78, ORS815, ORS243) с тринуклеотидными повторами мотивов.
В связи с этим необходимо было подобрать систему микросателлитных маркеров, способную выявить всё разнообразие коллекции селекционных линий ВНИИМК.
Цели исследования — генотипирование и оценка генетического разнообразия линий подсолнечника селекции ВНИИМК на основе мультиплексных систем новых микросателлитных локусов ДНК.
Материалы и методы исследования
Данная работа проводилась в 2023 году в лаборатории молекулярно-генетических исследований Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур им. В.С. Пустовойта.
В качестве материала для исследований использовали 28 линий селекции ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК. Генотипы представлены 13 материнскими и 15 отцовскими формами, стерильными линиями (А формы) и закрепителями стерильности (Б формы) (табл. 1).
ДНК выделяли из осевых органов зародыша сухой семянки подсолнечника с помощью набора реагентов «МагноПрайм ФИТО» («НекстБио», Россия) с применением автоматической станции для экстракции и очистки нуклеиновых кислот Auto-pure 96 (Allsheng, КНР).
Качественная и количественная оценка экстрагированной ДНК осуществлялась методом спектрофотометрии на спектрофотометре Nano-300 (Allsheng, КНР).
Для проведения реакции амплификации использовались 25 мкл реакционной смеси следующего состава: 67 мМ трис-HCl, рН 8,8; 16,6 мM сульфата аммония; 2,5 мM MgCl2; 0,01% Tween 20; по 0,2 мM каждого dNTP; по 10 пМ каждого праймера; 20 нг матричной ДНК и 1 ед. рекомбинантной термостабильной ДНК полимеразы (НПО «Сибэнзим», Россия).
Амплификацию выполняли в термоциклере MiniAmp plus (Thermo Scientific, США) при следующих температурно-временных режимах: начальная денатурация при 96 °С в течение 2 мин., затем 30–35 циклов: денатурация при 94 °С — 30 сек., отжиг при 60 °С — 40 сек., элонгация при 70 °С — 1 мин., финальная элонгация при 70 °С — 2 мин.
Для анализа использовали 16 маркеров микросателлитных локусов (МН1, МН2, МН3, МН4, МН5, МН6, МН7, МН8, МН9, МН10, МН11, МН12, МН13, МН14, МН15, МН16), разработанных авторами исследования, и 2 маркера, отобранных из источников литературы ORS78, ORS815.
Разделение продуктов амплификации, полученных с использованием пары праймеров, один из которых флуоресцентно меченый (FAM, R6G, TAMRA или ROX), осуществляли методом капиллярного электрофореза в денатурирующих условиях на генетическом анализаторе Нанофор-05 (ИАП РАН, РФ). Размер фрагментов определяли относительно размерного стандарта СD-600 меченым флуоресцентным красителем (Dy-632) с помощью GeneMarker software version 3.0.1. (State College, PA).
Анализ информативности микросателлитных локусов включал определение количества аллелей (Na), эффективного числа аллелей (Ne) и индекса полиморфного информационного содержания (PIC). Вычисления проводили с помощью компьютерного программного обеспечения GenAlEx 6.5 (Peakall and Smouse, Australia).
Определение генетических взаимоотношений между линиями в изучаемой коллекции основывалось на функции стандартного программного пакета Stats для языка программирования R версии 4.3.2 (R Core Team, 2023) по методу ward.D2.
Результаты и обсуждение
Согласно результатам прошлых исследований, выявлены два микросателлитных локуса (ORS78, ORS815), подходящих для генотипирования подсолнечника селекции ВНИИМК.
Маркеры микросателлитных локусов показали высокий дискриминационный потенциал, кодоминантное наследование и специфичность к целевому локусу. На основе отобранных из литературных источников и новых разработанных авторами микросателлитных маркеров были созданы 4 системы для мультиплексной ПЦР, состоящие из 4–5 пар праймеров.
Характеристики использованных в данной работе микросателлитных локусов представлены в таблице 2.
У изученных линий были обнаружены 130 аллелей, в среднем 7,22 аллеля на локус. Эффективное число аллелей находилось в пределах от 2,47 до 6,87 при среднем значении 4,45.
По результатам фрагментного анализа 28 линий были определены размеры ампликонов по каждому микросателлитному локусу. Размер аллелей находился в диапазоне от 153 до 536 п. н. Индекс PIC составил от 0,59 до 0,86, в среднем 0,75.
Наиболее полиморфными были маркеры MH6 и MH12. Их индекс PIC составил 0,85 и 0,86 соответственно. Наименее полиморфными оказались ORS78, ORS815 (PIC 0,60 и 0,59 соответственно).
Значения показателей информативности каждого микросателлитного локуса продемонстрированы в таблице 3.
Пригодность маркера для генотипирования и оценки генетического разнообразия зависит от числа аллелей, которыми обладает этот маркер, и их относительных частот встречаемости. Маркер считается полиморфным, если представлен как минимум двумя аллелями.
В целом все изученные в данной работе маркеры обладали высоким дискриминационным потенциалом (значение PIC выше 0,5) и являлись результативными для изучения генетического разнообразия и определения генетических дистанций между линиями.
В коллекции линий частота всех аллелей полиморфных локусов изменялась от 0,036 до 0,571. У 11 линий были выявлены уникальные аллели, встречающиеся только в одном генотипе.
По локусам MH12 и MH16 определено наибольшее количество уникальных аллелей (8 и 7 соответственно), частота встречаемости аллелей по данным локусам равна 0,036 (рис. 1).
Для определения генетических взаимоотношений между линиями был выполнен кластерный анализ с построением дендрограммы методом Ward. Генетические дистанции между линиями составили от 4 до 18 единиц (рис. 2). Это говорит том, что они имеют уникальные генотипы. Отличимость составила 100%.
По результатам анализа дендрограммы изученные линии были разделены на два основных кластера (I и II) на максимальном для данных генотипов уровне объединения.
Первый кластер характеризовался небольшим размером, включал только 4 материнские (ЦМС) линии ЦЭБ ВНИИМК. В этот кластер в том числе вошли образцы ВК1сур, ВК1клп и ВК680, которые имеют общее происхождение и являются аналогами по отношению друг к другу.
Следует отметить, что ранее, при паспортизации этих линий с помощью другого набора микросателлитных маркеров, мы не смогли отличить ВК1сур и ВК1клп друг от друга.
Второй кластер был значительно разнообразнее по составу и объединил все остальные линии изучаемых коллекций на уровне объединения 16,8 единицы. Однако он был подразделен на два субкластера — IIa и IIb. В субкластер IIa вошли восемь линий, в основном из коллекции линий ЦЭБ ВНИИМК (за исключением ВА389 и ЭД155 из коллекций АОС и ДОС ВНИИМК соответственно).
Все образцы этого субкластера представляли собой отцовские (Rf) формы гибридов. Второй субкластер (IIb) был более полиморфен как по происхождению линий, так и по отношению их принадлежности к ЦМС и Rf формам. В него вошли 16 линий, в основном происходящих из АОС и ДОС ВНИИМК.
Исключение составила линия ВК101Б из коллекции ЦЭБ ВНИИМК. Девять линий представляли собой материнские, а семь — отцовские формы гибридов.
В этом субкластере наблюдалось распределение в локальные группы по принципу принадлежности к ЦМС- или Rf-форме больше, чем к происхождению из коллекции.
Таким образом, для линий ВНИИМК прослеживается некоторая структурированность, которая заключается в том, что отцовские и материнские формы гибридов распределяются в разные группы по генетическому родству. Такой тип генетического родства был отмечен авторами и в предыдущих исследованиях.
Многие авторы отмечают вероятное происхождение ЦМС- и Rf-линий подсолнечника из разных генетических пулов. Однако, несмотря на такую группировку, изученные линии показали значительное генетическое разнообразие и дистанции между собой.
Полученные данные применимы при разработке технологии генотипирования и паспортизации генотипов подсолнечника при анализе генетического разнообразия и идентификации селекционного материала для подбора родительских форм с целью создания гибридов.
Выводы
По результатам исследования с применением разработанных авторами мультиплексных систем микросателлитных ДНК-маркеров удалось в короткие сроки идентифицировать и оценить генетическое разнообразие 28 линий подсолнечника селекции ВНИИМК.
Все использованные в данной работе маркеры обладали высоким дискриминационным потенциалом (значение PIC выше 0,5) и оказались результативными для изучения генетического разнообразия, определения генетических дистанций между линиями.
У 11 линий были выявлены уникальные аллели. Наибольшее их количество наблюдалось по локусам MH12 и MH16 (8 и 6 соответственно). В изученной коллекции частота аллелей полиморфных локусов изменялась от 0,036 до 0,571. Коллекция линий показала значительные генетическое разнообразие и дистанции между ними. Кластерный анализ отразил 100%-ную уникальность исследуемых генотипов селекции ВНИИМК.
Для коллекции линий прослеживается структурированность, заключающаяся в том, что отцовские и материнские формы гибридов распределились в разные группы генетического родства.
Об авторах
Анна Владимировна Головатская; младший научный сотрудник
annamoon11@gmail.com; https://orcid.org/0000-0001-8355-3150
Саида Заурбиевна Гучетль; кандидат биологических наук, заведующая лабораторией
saida.guchetl@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-2193-5230
Всероссийский научно-исследовательский институт масличных культур им. В.С. Пустовойта, ул. им. Филатова, 17, Краснодар, 350038, Россия
УДК 631.523:633.854.78
DOI: 10.32634/0869-8155-2024-388-11-117-121
