Главная страница » Молочная продуктивность и уровень кетоновых тел в крови коров костромской породы разных генотипов LEP

Рубрики

23.07.2024

Молочная продуктивность и уровень кетоновых тел в крови коров костромской породы разных генотипов LEP

В настоящее время учеными осуществляется поиск генов, связанных не только с повышенным уровнем молочной продуктивности, но и с сохранением функционального долголетия и здоровья коров, с высоким уровнем реализации их генетического потенциала, а также с отличительным качеством молочной продукции. С этой точки зрения перспективным является ген лептина (LEP), так как продукт его экспрессии вносит определенный вклад в энергетический обмен, регулирует нейроэндокринные процессы в организме.

У крупного рогатого скота ген лептина расположен в четвертой хромосоме и является высокополиморфным. Из 1385 однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) гена в открытых литературных источниках наиболее освещены полиморфизмы Y7F, A80V и R25C.

Вопрос о взаимосвязи гена лептина с наиболее ценными признаками не раз поднимался учеными и исследователями по всему миру. Так, H. Kulıg (2009 г.) установлено, что полиморфизм A80V гена лептина статистически значимо оказывал влияние на удой, а также выход белка и жира у коров джерсейской породы. Коровы с генотипом ТТ производили значительно меньше молока, чем сверстницы с другими генотипами (р < 0,05). Содержание жира в молоке коров с генотипом CC и CT было больше, чем у ТТ (р < 0,01).

Позднее Ф.Ф. Зиннатовой с соавторами (2017 г.) в исследовании этого полиморфизма на коровах голштинской породы установлено, что высоким уровнем молочной продуктивности обладают животные с гомозиготным СС-генотипом гена лептина. Удой коров данной группы составил 6802,2 кг (в среднем), что на 498,7 кг молока больше, чем в группе с генотипом ТТ (р < 0,05). Высоким содержанием жира и белка в молоке обладали коровы гетерозиготного генотипа (р < 0,05).

По сведениям Э.Р. Гайнутдиновой с соавторами (2021 г.), среди коров-первотелок голштинской породы наибольшими удоями за лактацию обладали животные с генотипом СС, а белковомолочностью — СТ. Напротив, преобладание по МДЖ наблюдалось у коров с генотипом TT.

При изучении L. Giblin (2010 г.) полиморфизма Y7F гена лептина у крупного рогатого скота было установлено, что он ассоциирован с запасанием энергии в виде отложений жировой ткани. При этом аллель Y оказался достоверно связан с уменьшением выхода молочного белка. В целом учеными предложено рассматривать данный полиморфизм гена лептина как маркер воспроизводительной способности коров.

При исследовании влияния полиморфизма R25C гена лептина на продуктивность R.C. Chebel c соавторами (2008 г.) наблюдалась тенденция к увеличению количества и качества получаемого молока у коров голштинской породы генотипов СТ и ТТ. Особи СС-генотипа обладали наименее жирным молоком (3,45%) по сравнению с генотипами CT и TT. По показателям белковомолочности существенной разницы выявлено не было.

В исследовании другого коллектива авторов наиболее высоким уровнем молочной продуктивности отличались коровы черно-пестрой породы с генотипом RR, а сверстницы генотипа CC — наибольшим содержанием жира и белка в молоке. В то же время, по данным А.А. Ярышкина и соавторов (2022 г.), у коров генотипа RR черно-пестрой голштинизированной породы отмечали более высокий удой и МДЖ.

Продуктивные качества и технологические свойства молока тесно связаны со здоровьем коров. В условиях интенсификации молочного скотоводства система обмена веществ коровы находится в состоянии максимальной физиологической нагрузки, что может привести к развитию кетоза. Кетоз сопровождается накоплением повышенного количества кетоновых тел в крови (кетонемия), моче (кетонурия) и молоке (кетонолактия), уменьшением содержания глюкозы в крови (гипогликемия). Заболевание приводит к снижению уровня и качества молочной продуктивности, сокращению срока хозяйственного использования животных, нарушению репродуктивной функции коров.

Исследователями было выдвинуто предположение, что ген лептина может выступать как генетический маркер кетоза. Так, при полногеномном ассоциативном исследовании на коровах голштинской породы S. Nayeri (2019 г.) установлено, что LEP достоверно связан с субклиническим кетозом.

Отечественными исследователями Л.И. Якушевой и др. (2019 г.) при проведении ассоциативных исследований по данному вопросу указано, что генотип CC гена лептина у крупного рогатого скота является одним из факторов риска развития этого заболевания. Этими учеными в более поздней публикации отмечено, что комплексные генотипы полиморфизмов R25C, Y7F, A80V гена лептина отцов AARRYY для дочерей и AARCYY для коров голштинской породы характеризуются устойчивостью к кетозу.

Таким образом, по данным литературного обзора учеными было установлено влияние гена лептина на уровень и качество молочной продуктивности коров, а также наблюдаются попытки определения ассоциации полиморфизма гена с предрасположенностью к кетозу крупного рогатого скота. Данные исследования в основном проводились на голштинской и черно-пестрой голштинизированной породах коров.

Цель исследования — изучить молочную продуктивность и содержание кетоновых тел в крови коров костромской породы разных генотипов по гену лептина.

Задачи: определить уровень молочной продуктивности и концентрацию кетоновых тел в крови у коров костромской породы первой лактации АО «Племзавод “Караваево”» Костромской области; установить связь субклинического кетоза с уровнем молочной продуктивности коров костромской породы первой лактации АО «Племзавод “Караваево”» Костромской области; прогенотипировать коров костромской породы первой лактации по гену лептина; провести анализ уровня молочной продуктивности и количества кетоновых тел в крови коров костромской породы разных генотипов LEP.

Материалы и методы исследования

Научную работу осуществляли в 2022–2023 гг. на материально-технической базе лаборатории генетики и ДНК технологий Костромской ГСХА.

Объект исследования — коровы костромской породы (n = 107) первой лактации АО «Племзавод “Караваево”» Костромской области. Данные зоотехнического учета были получены из информационно-аналитической системы «СЕЛЭКС» (Россия), ветеринарного учета — из программы «М-комплекс» (Россия).

У коров в послеродовый период с 1-го по 10-й день после отела экспресс-методом с помощью анализатора TIADOC-4235Е (Taidoc Technology Corporation, Тайвань) определяли количество кетоновых тел в крови. С учетом этого были сформированы группы клинически здоровых коров: 1-я — 0–1,2 ммоль/л (норма), 2-я — выше 1,2 ммоль/л (субклинический кетоз).

В качестве источника ДНК для генетических исследований использовали цельную периферическую кровь коров. Проводили отбор биоматериала из хвостовой вены коров в пронумерованные вакуумные системы с антикоагулянтом ЭДТА (Германия). Геномную ДНК получали сорбентным способом (Россия).

Поиск последовательностей генов выполнен с помощью баз данных NCBI и Ensembl. Для анализа нуклеотидных последовательностей, подбора праймеров и зондов использовали программу Oligo 6.0. Праймеры и зонды синтезированы в аккредитованной биотехнологической компании (Россия). Контроль качества ДНК и праймеров осуществляли методом агарозного электрофореза.

Полиморфизм R25C гена LEP (rs29004488) определяли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). Амплификацию образцов ДНК проводили с использованием амплификатора «ДТпрайм» (Россия) при температуре отжига праймеров 59 ºС.

В состав смеси для постановки ПЦР (на 1 образец) входило 5 мкл образца ДНК, 20 мкл ПЦР-смеси, 0,24 мкл 25мМ дезоксинуклеозидтрифосфат (dNTP), 10 мкл раствора полимеразы (0,5 мкл TAQ полимеразы и 9,5 мкл ПЦР-буфера). В состав ПЦР-смеси входили следующие компоненты: зонд FAM и HEX по 0,1 мкл, зонд BHQ — 0,3 мкл, праймер rev — 0,6 мкл, праймер for — 0,1 мкл.

LEP_for 5`-CgT gTg gTT TCT TCT gTT TTC Agg C-3`

LEP_rev 5` CCC AgT CCC TCC CTA CCg TgT g-3`

LEP_BHQ (BHQ1)-5`-gAT gAC ACC AAA ACC CTC AT-3`-(P)

LEP_C 5`-CAT CCg CAA ggT CCA g-3`-(FAM)

LEP_T 5`-CAT CTg CAA ggT CCA g-3`-(HEX)

Генотип определяли методом анализа кривых плавления.

Частоту встречаемости генотипов LEP рассчитывали по формуле 1:

P = m/N,

где Р — частота встречаемости генотипа в группе, m — количество носителей определенного генотипа, N — общее число особей.

Частоту встречаемости аллельных вариантов гена LEP в группах подопытных животных вычисляли по формуле 2:

где p — частота встречаемости аллеля С; q — частота встречаемости аллеля Т; n_СС, n_СТ, n_ТТ — число носителей генотипов СС, СТ и ТТ соответственно;

N — общее число животных в группе.

Равномерность распределения аллелей гена в изучаемых группах животных и генное равновесие оценивали при помощи уравнения Харди-Вайнберга (3):

p²+ 2pq + q²= 1,

где p и q — частоты аллелей С и Т соответственно.

Расчеты популяционно-генетических параметров проводились при помощи Microsoft Excel (2019 г.) (США). Статистическую значимость разности между группами животных определяли путем расчета t-критерия Стьюдента. Проверку гипотезы независимости распределения аллелей в подопытных группах животных осуществляли методом «хи-квадрат» (χ²), различие между наблюдаемым и ожидаемым частотным распределением считали статистически значимым при

р < 0,05. Коэффициент ранговой корреляции Спирмена rho вычисляли при помощи языка статистического программирования R версии 4.3.2.

Результаты и обсуждение

В результате генотипирования по гену лептина было выявлено следующее распределение генотипов коров (рис. 1).

Установлено, что в 1-й группе коров наибольшее распространение имел аллельный вариант LEP^C (рис. 1). При этом носители гомозиготного генотипа LEP^CC встречались наиболее часто — 0,468, превосходя сверстниц с генетическими вариантами CT и TT на 5,5% и 80,5% соответственно.

Во 2-й группе, представленной коровами с субклиническим кетозом, одинаково часто регистрировались носители генетических вариантов LEP^CC и LEP^CT (0,469) на фоне сравнительно низкой частоты генотипа TT (0,063).

Сравнение распределения генотипов LEP в 1-й и 2-й группах показало, что среди коров с субклиническим кетозом чаще встречаются гетерозиготы (на 2,72%) по сравнению с группой здоровых животных, а носительницы генотипа TT, напротив, встречаются реже (на 2,84%). При этом разница между распределениями генотипов LEP в 1-й и 2-й группах была достоверной (р < 0,001).

В целом, по данным генотипирования, в обеих группах наблюдалось схожая частота разных генетических вариантов гена лептина. Популяционно-генетический анализ не выявил недостатка или избытка гетерозигот: теоретически ожидаемое значение, согласно закону Харди — Вайнберга, было близко к фактическому в обеих группах, что говорит о соблюдении генетического равновесия в рамках локуса LEP R25C.

Учитывая небольшую, но значимую разницу в распределении генотипов LEP между опытными группами, имеет смысл рассмотреть характер распределения частот аллельных вариантов данного локуса (рис. 2).

Согласно данным (рис. 2), в 1-й группе коров костромской породы наиболее часто определялся аллель LEP^C — у 68% коров при частоте LEP^T-аллеля на уровне 0,312. Во 2-й группе LEP^C-вариант был у 70%, а LEP^T— у 30% животных. Однако, несмотря на столь небольшое различие, разница в распределении частот встречаемости аллелей LEP в 1-й и 2-й группах оказалась статистически значимой (χ²= 63,48, р < 0,001).

Затем провели сравнение содержания кетоновых тел в крови коров с разными генотипами по гену LEP (рис. 3).

Так, данные (рис. 3) показывают практически одинаковую концентрацию кетоновых тел в крови коров 1-й группы без влияния генотипов LEP. Среди животных 2-й группы наибольшее количество кетоновых тел в крови определяли у животных с генотипом LEP^CT, тогда как носители гомозиготных генотипов по данному показателю практически не различались, однако разница была статистически незначимой.

Рассмотрим молочную продуктивность (удой, массовую долю жира в молоке — МДЖ, массовую долю белка в молоке — МДБ) подопытных коров с разных генотипов по гену LEP и с различным уровнем кетоновых тел (табл. 1).

Анализ данных молочной продуктивности подопытных животных показывает отсутствие статистически значимых различий между коровами разных генотипов LEP как по удою, так и по содержанию жира и белка в молоке (табл. 1). Различия между носительницами одного и того же генотипа LEP с разным уровнем кетоновых тел оказались более выраженными: коровы с более высоким удоем и содержанием жира в молоке характеризовались тенденцией к повышенной концентрации кетонов в крови, что согласуется с данными других исследователей. Примечательно, что разница по удою между носительницами генотипа LEP^CC 1-й и 2-й групп оказалась статистически значимой (р < 0,05) и составила 1139 кг (11,9%) в пользу животных с повышенным уровнем кетоновых тел в крови. Имеется тенденция к наиболее высокому содержанию жира в молоке у коров 2-й группы генотипа LEP^СТ и LEP^ТТ.

Для проверки гипотезы о значимой зависимости уровня молочной продуктивности от концентрации кетоновых тел в крови носительниц генотипа CC был рассчитан коэффициент ранговой корреляции Спирмена (rho) между данными показателями. Статистически значимое значение rho, как и ожидалось, было получено среди коров с генотипом CC на уровне 0,37 (р = 0,038). Ранговая корреляция между удоем и содержанием кетоновых тел у носительниц генотипов CT и TT была слабой (-0,005 и 0,088 соответственно) и недостоверной (р > 0,05).

Связь между уровнем кетоновых тел в крови коров и содержанием жира в молоке (вопреки ожиданиям) не проявилась в виде статистически значимой величины коэффициента ранговой корреляции. Так, для носительниц генотипа CC rho составил -0,031 (р = 0,867), генотипа CT — 0,108 (р = 0,534), а для животных с генотипом TT — 0,716 (р = 0,109). Тем не менее проявленная тенденция к тесной связи между уровнем кетоновых тел и содержанием жира в молоке коров-носительниц генотипа TT может свидетельствовать о влиянии данного генотипа на МДЖ и уровень кетоновых тел в крови животных, однако для подтверждения этой теории необходимо исследование на большем поголовье коров с генотипом TT по гену лептина.

Выводы

Таким образом, данные исследования показывают наличие предрасположенности высокопродуктивных коров к кетозу: у животных 2-й группы продуктивность была на 11,9% выше, чем в 1-й (р < 0,05). Наибольшее количество кетоновых тел в крови определяли у животных 2-й группы с генотипом LEP^CT, однако не было установлено достоверного влияния генотипа LEP R25C на предрасположенность к кетозу коров. Однако, несмотря на столь небольшое различие, разница в распределении частот встречаемости аллелей LEP в 1-й и 2-й группах оказалась статистически значимой (χ²= 63,48, р < 0,001). При проверке гипотезы о значимой зависимости уровня молочной продуктивности от концентрации кетоновых тел в крови носительниц генотипа CC было получено статистически значимое значение rho среди коров с генотипом CC на уровне 0,37 (р = 0,038). Ранговая корреляция между удоем и содержанием кетоновых тел у носительниц генотипов CT и TT была слабой и недостоверной (р > 0,05). Тенденция к тесной связи между уровнем кетоновых тел и содержанием жира в молоке коров генотипа TT ввиду низкой его концентрации в выборке требует подтверждения на большем поголовье коров с этим генотипом по гену лептина.

Об авторах

Ксения Дмитриевна Сабетова; кандидат ветеринарных наук, заведующая лабораторией генетики и ДНК технологий

kseniyasabetova@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-3282-4779

Александр Дмитриевич Лемякин; селекционер-зоотехник

whichspecial@gmail.com; https://orcid.org/0000-0002-7737-6351

Алексей Александрович Чаицкий; кандидат биологических наук, преподаватель

aleksei_chaitskiy@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-5853-3809

Павел Олегович Щеголев; кандидат сельскохозяйственных наук, селекционер-зоотехник

bigboy25@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-3552-8457

Лада Сергеевна Баданина; студент

lada.badanina2017@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-1286-3714

Никита Юрьевич Метляев; аспирант