Комплексный анализ влияния эссенциальных элементов на бактериальные штаммы Bacillussp. в модельном эксперименте invitro
Клеточная структура микроорганизма способна улавливать ионы тяжелых металлов и впоследствии сорбировать их на местах связывания клеточной стенки. Данный процесс называется биосорбцией (или пассивным поглощением) и не зависит от метаболического цикла.
Количество сорбированного металла зависит от кинетического равновесия и состояния металла на клеточной поверхности. Механизм включает в себя несколько процессов: электростатическое взаимодействие, ионный обмен, осаждение, окислительно-восстановительные реакции, поверхностное комплексообразование. Эти процессы быстрые и могут реализовываться в течение нескольких минут.
Биосорбция может осуществляться фрагментами клеток, мертвой биомассой или живыми клетками в виде пассивного поглощения посредством поверхностного комплексообразования на клеточной стенке и других внешних слоях.
Другой метод представляет собой процесс, при котором ионы тяжелых металлов проходят через клеточную мембрану в цитоплазму в рамках клеточного метаболического цикла. Это называется биоаккумуляцией или активным поглощением. Биоаккумуляция является сложным процессом живой клетки, который зависит от множества физических, химических и биологических механизмов. Эти факторы включают внутриклеточные и внеклеточные процессы, где биосорбция играет ограниченную и неясную роль. Организм, который будет накапливать тяжелые металлы, должен иметь толерантность к одному или нескольким металлам в более высоких концентрациях и должен проявлять повышенные трансформационные способности, переводя токсичные химические вещества в безвредные формы, что позволяет организму уменьшить токсическое действие металла.
Механизмы поглощения металлов различными биосорбентами зависят от клеточной поверхности микроорганизмов, от обмена ионов металлов и комплексных образований с ионами металлов на химически активных участках клеточной поверхности. Они были тщательно изучены в отношении различных изотерм биосорбции, полученных в результате экспериментов по сорбции и влиянии различных факторов, таких как pH, предварительная обработка биомассы и биомасса организмов. Затем на поверхности клетки происходит осаждение избыточных ионов металлов в результате реакций нуклеации. Все микроорганизмы имеют отрицательный заряд на поверхности своих клеток из-за наличия анионных структур, которые позволяют им связываться с катионами металлов. Отрицательно заряженными группами, участвующими в адсорбции металлов, являются спиртовая, аминная, карбоксильная, сложноэфирная, гидроксильная, сульфогидрильная, фосфорильная, сульфонатная, тиоэфирная и тиоловая группы.
Биоремедиация использует генетическое разнообразие и метаболическую универсальность микроорганизмов для преобразования загрязняющих веществ в менее вредные конечные продукты, которые затем интегрируются в естественные биогеохимические циклы. Основные пути биоремедиации заключаются в снижении растворимости загрязнителей окружающей среды за счет изменения pH, окислительно-восстановительных реакций и адсорбции загрязнений.
Бактерии, восстанавливающие железо (III), играют важную роль в деградации органического вещества естественного происхождения и в круговороте тяжелых металлов в морских и пресноводных отложениях, активно участвуют в биогеохимическом цикле углерода и азота в природе.
Биосорбция является экологически чистым и экономически эффективным удобным методом биоремедиации тяжелых металлов из загрязненной водной экосистемы. Так, в исследовании, проведенном В. Шарма и соавт., установлено, что штамм Bacillus subtilis (MN093305), выделенный из реки Ганг при pH 7, 72 ч., 35 °C, сорбирует железо до 95,02%. Кришна Канамарлапуди и Муддада в изотермических и кинетических исследованиях биосорбции железа (II) биомассой Bacillus subtilis из водных растворов установили, что оптимальная биосорбционная емкость составляет 7,25 мг металла на 1 г биосорбента в экспериментальных условиях начальной концентрации металла 100 мг/л, pH 4,5 и дозы биомассы 1 г/л при 30 °C в течение 24 ч.
Цель исследования — оценить степень влияния эссенциальных элементов на рост и антагонистическую активность штаммов Bacillus sp., входящих в состав пробиотических препаратов.
Материалы и методы исследований
Исследования проводились на кафедре биохимии и микробиологии Оренбургского государственного университета в 2023 году. В качестве объектов исследования использовались музейные образцы пробиотических штаммов Bacillus sp.: B. subtilis 534 («Споробактерин», ООО «Бакорен», г. Оренбург, Россия), B. cereus IP 5832 («Флонивин БС», Galenika Crna Gora, D. O. O., Черногория), B. licheniformis ВКПМ В 7038 («Ветом 4», ООО НПФ «Исследовательский центр», Новосибирская обл., Россия), клинические изоляты E. coli и S. aureus.
В качестве регулирующих рост факторов моно- и полиметального загрязнения субстрата использовали соли металлов (ЧДА) FeSO4 × 7H2O, CuSO4 × 5H2O и ZnSO4 × 7H2O (АО «ЛенРеактив», г. Санкт-Петербург, Россия).
Для реализации поставленных задач использовали комбинирование методов серийного разведения с диффузионным методом агаровых лунок. Сочетание представленных методических подходов позволило оценить уровень резистентности исследуемых штаммов к тестируемым химическим соединениям и степень антагонистической активности.
Серия разведения солей металлов в условиях базового эксперимента, направленного на уровень пороговых значений толерантности пробиотических штаммов, колебалась в диапазоне от 1,000 до 0,016 М, что в свою очередь позволило определить рабочие концентрации солей эссенциальных элементов (минимальная доза, не оказывающая ингибирующее действие) для проведения дальнейших исследований.
Суть метода заключается в высеве суспензии исследуемых микроорганизмов (0,5 по МакФарланду) на поверхность стерильного агаризованного субстрата (2,0%). После высева культуры клеток газоном с использованием шпателя Дригальского стерильным микробиологическим пробойником в толще агара были сделаны 7 отверстий диаметром 5 мм на удалении 1,5 см от края чашки (диаметр 90 мм) и 3,0 см между лунками. В лунки в объеме 30 мкл вносили раствор соли металла по часовой стрелке с убыванием концентрации. Чашки помещали в термостат для инкубирования культуры клеток при температуре 37 °С в течение 24 часов. Уровень биологического действия оценивали визуально путем замера зон ингибирования роста (бактерицидный эффект) или их отсутствия.
Антагонистическую активность исследовали диффузионным методом. Предварительно тестируемые пробиотические штаммы Bacillus sp. культивировали в жидкой питательной среде (ГРМ-бульон), контрольные образцы без добавления металла, опытные — в присутствии солей исследуемых элементов в течение 48 ч. при температуре 37 °С. После культивирования пробирки центрифугировали в течение 30 мин. при 3000 об/мин.
Для исследования использовали надосадочную жидкость (супернатант). В чашках Петри на поверхности 2% ГРМ-агара высевали суспензию E. coli и S. aureus (0,5 по МакФарланду) в объеме 100 мкл с равномерным распределением газоном шпателем Дригальского. В лунки в толще агаризованой пластинки, сделанные микробиологическим пробойником, вносили по 30 мкл супернатанта в последовательности: контрольный образец и опытные (рост в присутствии рабочих концентраций FeSO4 × 7H2O, CuSO4 × 5H2O и ZnSO4 × 7H2O).
Влияние металлов на антагонистские характеристики Bacillus sp. проводили посредством замера зон ингибирования роста микроорганизмов по отношению к контрольным образцам после инкубирования тест-организмов в течение 24 ч. при температуре 37 °С.
Степень влияния эссенциальных элементов на динамические показатели роста бактериальной культуры определяли с использованием нефелометрического метода посредством регистрации оптической плотности суспензии с интервальными замерами через каждые 3 ч. до наступления трехкратно повторяющихся результатов, что свидетельствовало о выходе тест-организмов на максимальные показатели роста.
Уровень сорбционной емкости исследуемых микроорганизмов оценивали с использованием атомно-абсорбционной спектрофотометрии. В условиях монометального загрязнения субстрата в ГРМ-бульон в объеме 400 мл вносили рабочие концентрации раствора металла с последующим добавлением суспензии микроорганизмов и культивировали их до наступления стационарной фазы роста (время определялось на основании нефелометрического метода) при температуре 37 °С. Содержимое флаконов центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 мин. с последующим отделением супернатанта. Бактериальные клетки в структуре биомассы лизировали путем добавления 5% раствора KOH и выдерживали в водяной бане при температуре 98 °С в течение 30 мин. Анализу подвергали как биомассу, так и супернатант в пересчете в процентах содержания металлов в тестируемых образцах от объема внесенного соединения в субстрат.
Влияние солей исследуемых элементов на морфометрические показатели бактериальных клеток, оценку уровня локализации металлов проводили с использованием атомно-силовой микроскопии с модифицированной методикой пробоподготовки.
Все экспериментальные исследования проводились в 10-кратных повторах с последующей статистической обработкой (средний, ошибка среднего, t-критерий Стьюдента (определение достоверности полученных результатов) с использованием программ Exсel (США) и AtteStat(США).
Результаты и их обсуждение
В рамках проведенных исследований было установлено, что все исследуемые химические соединения эссенциальных элементов в концентрациях от 1,000 М до 0,250 М обладают выраженным ингибирующим действием в отношении тестируемых пробиотических штаммов рода Bacillus sp. (табл. 1).
Наиболее высокие показатели толерантности к действию солей эссенциальных элементов установлены у штамма B. cereus IP 5832, превышающего аналогичные показатели по концентрации меди на 49,97% и 74,99% для B. licheniformis ВКПМ В 7038 и B. subtilis 534 соответственно. В отношении цинка B. licheniformis ВКПМ В 7038 и B. subtilis 534 имеют идентичные показатели резистентности к концентрации 0,031 М, в то время как B. cereus IP 5832 проявляет устойчивость к 0,063 М.
В отношении железа установлена родовая резистентность к концентрации FeSO4 0,063 М и менее. Полученные в ходе этого этапа реализации проекта данные позволили определить рабочие концентрации солей металлов для выполнения других задач, направленных на анализ влияния эссенциальных элементов на исследуемые штаммы Bacillus sp.
Второй этап реализации проекта направлен на влияние исследуемых химических соединений эссенциальных элементов на динамические показатели роста (рис. 1, 2) бактериальных штаммов рода Bacillus sp. Реализация данного этапа сопряжена с необходимостью определения стационарной фазы роста в условиях периодического культивирования микроорганизмов, так как металлы активно сорбируются и биотрансформируются бактериальными клетками в фазу активного роста и начального этапа выхода роста популяции на плато.
В условиях монометального экспериментального загрязнения субстрата железом большинство тестируемых штаммов демонстрируют более высокие показатели оптической плотности по отношению к контролю с сокращением времени выхода популяции клеток на стационарную фазу, максимальные показатели оптической плотности регистрируются у штамма B. subtilis 534 как в присутствии железа, так и в интактном образце.
Гипотетически данный механизм можно объяснить высокими показателями сорбции, вследствие чего изменяется оптическая плотность бактериальной суспензии (рис. 1).
В условиях полиметального загрязнения все исследуемые штаммы демонстрируют схожую картину динамики роста популяции и имеют более высокие показатели оптической плотности в опытных образцах по отношению к контрольным группам, при этом следует отметить, что наиболее значимые различия наблюдаются по мере приближения стационарной фазы на 10,97% для B. subtilis 534 (p < 0,01), 15,86% — B. cereus IP 5832 (p < 0,001), 12,26% — B. licheniformis ВКПМ В 7038 (p < 0,001) соответственно (рис. 2). Обращает внимание отсутствие временного сдвига наступления стационарной фазы, в отличие от монометального загрязнения.
Основной блок экспериментальных исследований, направленный на оценку биоремедиационного потенциала исследуемых бактериальных штаммов, заключался в определении их сорбционной емкости в условиях моно- и полиметального загрязнения субстрата (рис. 3, 4).
Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о высоком уровне сорбции железа и цинка из субстрата в условиях массированной катионной нагрузки, вызванной введением рабочих концентраций солей металлов в питательную среду.
В отношении железа максимальными показателями аккумуляции обладает B. subtilis 534 и составляет 47,98% (p < 0,01) против 34,67% B. cereus IP 5832 и 33,80% B. licheniformis ВКПМ В 7038.
В отношении цинка максимальные показатели накопления элемента в биомассе регистрируются у штамма B. cereus IP 5832 и составляют 44,96%, что на 2,46% превышает процент аккумуляции популяцией клеток B. subtilis 534 и на 4,62% B. licheniformis ВКПМ В 7038 соответственно.
Анализ экспериментальных данных по оценке сорбционных характеристик исследуемыми микроорганизмами катионов меди из субстрата свидетельствует о выраженном доминировании B. licheniformis ВКПМ В 7038, так как уровень сорбции у данного штамма значительно превышает аналогичный показатель у B. subtilis 534 (на 14,24%) и B. cereus IP 5832 (на 17,52%) в абсолютных значениях.
В условиях полиметального загрязнения наблюдается общая тенденция к аккумуляции по отношению к показателям монометальной нагрузки на субстрат, что проявляется максимальными показателями сорбции железа и цинка у B. subtilis 534 и меди у B. licheniformis ВКПМ В 7038.
Для определения локализации сорбируемых элементов была проведена атомно-силовая микроскопия по модифицированной методике пробоподготовки, базирующейся на культивировании бактериальных штаммов на плотных питательных средах. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о выраженном действии исследуемых металлов на морфометрические показатели исследуемых микроорганизмов (рис. 5), характеризующиеся изменением размера, формы и способа локализации по отношению друг к другу.
Анализируя данные (рис. 5), следует отметить не только изменение морфологии клеток изучаемой культуры (сокращение длины (рис. 5А), отсутствие построения в цепочки (рис. 5А, 5Б), но и наличие металлизированных комплексов на поверхности бактериальных клеток, что наиболее явно представлено на рисунке 5А. При этом следует отметить, что сорбция меди осуществляется не всей поверхностью, а локализуется на определенных участках (на одном из полюсов).
Следует отметить, что визуализация представленных данных позволяет с высокой долей уверенности судить о формировании ультрадисперсных смешанолигандных комплексов на бактериальной поверхности.
Представители рода Bacillus sp. обладают высокими показателями антагонистической активности. В условиях проводимого эксперимента была проведена оценка влияния эссенциальных элементов на антагонистические характеристики исследуемых штаммов в модельном эксперименте in vitro в отношении S. aureus и E. coli.
Полученные данные контрольного образца свидетельствуют о выраженном ингибирующем действии продуктов жизнедеятельности (вторичных метаболитов) пробиотических штаммов в отношении тест-организмов, максимальные показатели диаметрально удаленного ингибирования роста S. aureus регистрируются при внесении в лунку супернатанта после 48-часового культивирования B. subtilis 534 (табл. 2).
Внесение в субстрат солей исследуемых элементов у данного микроорганизма вызывает негативное влияние на уровень активности вторичных метаболитов как в отношении грамположительного, так и грамотрицательного тест-организма. Наиболее выраженное влияние оказывает медь, снижая степень антагонистической активности на 62,84% (p < 0,001) в отношении S. aureus и на 33,33% (p < 0,05) в отношении E. coli.
Экспериментально установлено, что культивирование штаммов B. cereus IP 5832 и B. licheniformis ВКПМ В 7038 в присутствии FeSO4 в концентрации 9,49 мг/мл увеличивает уровень антагонистической активности указанных штаммов в отношении E. coli на 32,63% (p < 0,01) и на 36,77% (p < 0,05). На уровне гипотезы можно предположить, что присутствие железа увеличивает проницаемость мембраны грамотрицательной клетки, вследствие чего возрастает степень ингибирующего действия антибиотикоподобных соединений, продуцируемых бактериальными штаммами Bacillus.
Выводы
Проведенный системный анализ комплексной экспериментальной оценки влияния эссенциальных элементов на представителей рода Bacillus позволяет с высоким уровнем достоверности констатировать, что все исследуемые штаммы обладают идентичным уровнем резистентности в отношении железа (9,49 мг/мл). Наиболее высокие показатели устойчивости к меди и цинку регистрируются у B. cereus IP 5832, для которого рабочие концентрации солей данных элементов составили 19,95 мг/мл и 10,09 мг/мл соответственно.
Присутствие солей в субстрате оказывает выраженное действие на динамические показатели роста. Однако следует отметить, что данное явление может быть обусловлено высокими показателями сорбции железа и цинка, что в свою очередь влияет на показатели оптической плотности как отдельных клеток, так и популяции в целом, что подтверждается результатами исследования сорбционной емкости исследуемых штаммов.
Установлено, что все исследуемые пробиотические штаммы рода Bacillus активно сорбируют из субстрата железо до 47,98% и цинк до 44,96%. Однако в отношении меди относительно высокую аккумулирующую активность проявляет B. licheniformis ВКПМ В 7038, содержание металла в биомассе которого составило 22,35%, против 8,11% у B. subtilis 534 и 4,83% у B. cereus IP 5832.
Анализ данных влияния исследуемых элементов на антагонистическую активность свидетельствует о том, что присутствие меди и цинка в субстрате оказывает негативное влияние на выработку антибиотикоподобных соединений всеми исследуемыми штаммами. Положительная динамика наблюдается лишь в присутствии FeSO4 в концентрации 9,49 мг/мл, что увеличивает показатели антагонистической активности штаммов B. cereus IP 5832 и B. licheniformis ВКПМ В 7038 в отношении E. coli на 32,63% (p < 0,01) и 36,77% (p < 0,05).
Об авторах
Алексей Николаевич Сизенцов; кандидат биологических наук, доцент кафедры биохимии и микробиологии
asizen@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-1099-3117
Людмила Вячеславовна Галактионова; кандидат биологических наук, доцент, заведующая кафедрой биологии и почвоведения
anilova.osu@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-0781-3752
Ольга Константиновна Давыдова; кандидат биологических наук, доцент кафедры биохимии и микробиологии
okdavydova@yahoo.com; https://orcid.org/0000-0002-1067-0337
Оренбургский государственный университет, пр-т Победы, 13, Оренбург, 460018, Россия
УДК 574.23, 574.24, 574.474, 579.222.4
DOI: 10.32634/0869-8155-2024-388-11-39-45
