Изучение действия бетулиносодержащей кормовой добавки на лизоцимную и бактерицидную активность сыворотки крови телят и коров дойного стада
При современном уровне физического, химического и биологического загрязнения окружающей среды сельскохозяйственные животные, так же как и люди, страдают от иммунодефицита — разбалансировки нормального функционирования иммунной системы. Это приводит к существенному снижению общей сопротивляемости организма животного к различным заболеваниям вирусной и бактериальной этиологии. У коров снижаются показатели продуктивности и воспроизводительная способность, у молодняка нарушается положительная динамика увеличения живой массы тела.Условия, которые создают дополнительный стресс для животных, например неправильно сбалансированный рацион, инфекционные и инвазионные болезни или акушерско-гинекологические заболевания, усугубляют ситуацию. При анализе качества корма необходимо обращать внимание на природные загрязнители, в том числе на микотоксины, которые продолжают оказывать серьезное воздействие на здоровье животных.Таким образом, восстановление нормального функционирования иммунной системы животного, создание более напряженного иммунитета с помощью новых кормовых добавок, основу которых составляют биологически активные вещества растительного происхождения, в настоящее время являются весьма актуальными.
В области ветеринарной медицины активно развиваются новые направления решения проблемы инфекционных болезней — создание и применение препаратов растительного происхождения, способных оказывать физиологически значимые эффекты на организм животного, такие как иммуномодулирующее, антиоксидантное и антимикробное действие.
Биоактивные природные компоненты характеризуются низкой токсичностью, высокой доступностью в качестве сырьевой базы и относительно просты в экстракции.
К таким природным соединением относится природный пентациклический тритерпеноид лупанового ряда — бетулин. Он содержится в большом количестве растений (орешнике, календуле, солодке), но в промышленных масштабах его получают экстракцией из бересты — наружного слоя коры березы белой (Betula Alba), повислой (Betula Pendula).
Тритерпеноиды бересты, в частности бетулин и его производные, обладают биологической активностью, которая детерминирована их естественными функциями в растительных тканях, где данные соединения обеспечивают резистентность к абиотическим стрессам (УФ-радиации, температурным колебаниям) и биотическим угрозам, включая бактерии, грибы, вирусы и насекомых-вредителей.
Бетулин является объектом длительного изучения в медицине, в том числе ветеринарной. Доказано, что данное соединение проявляет иммуномодулирующую активность путем потенцирования иммунного ответа на патогены. Этот эффект опосредован активацией макрофагов — клеток, ответственных за фагоцитоз бактерий и инфицированных вирусами клеток. Помимо этого, бетулин и его производные индуцируют синтез интерферона, тем самым усиливая противовирусную резистентность организма. Поскольку активные формы кислорода (АФК) генерируются как в условиях патологии, так и в ходе физиологического процесса тканевого дыхания, важным свойством бетулина является его выраженная антиоксидантная активность. Он обеспечивает протекцию клеточных мембран от пероксидативного повреждения, выступая в роли защитного агента.
В ветеринарии положительные результаты от применения бетулина были получены для лечения крупного рогатого скота при болезнях слизистых оболочек — инфекционном ринотрахеите и вирусной диареи (ИРТ ВД-БС), свиней и телят при инфекционных болезнях смешанной этиологии, при изучении влияния бетулина на состояние здоровья собак и птицы.
Препараты «Бетулин-экстракт» (БЭ) для перорального применения и растворимая форма «Бетулин-ЭПГ» для парентерального применения с положительным результатом были испытаны на лабораторных животных, птице, телятах и северных оленях. Исследования, направленные на изучение биологической активности растительных тритерпеновых соединений, являются актуальными. Одним из перспективных направлений в данной области является изучение молекулярных механизмов действия бетулина и его синтетических производных на показатели неспецифической резистентности организма сельскохозяйственных животных. Невосприимчивость его к воздействию разнообразных патогенных факторов приобретает критическое значение, в особенности в условиях интенсивного животноводства, сопряженного с высокой производственной нагрузкой. В связи с этим, крупный рогатый скот (КРС) должен иметь высокую адаптивность к стрессам, устойчивость к заболеваниям и потенциалом для длительного продуктивного использования, что особенно актуально для дойных коров.
Объективную и комплексную оценку состояния системы естественной резистентности организма животных обеспечивает мониторинг клеточного и гуморального звеньев неспецифического иммунитета по показателям периферической крови.
В связи с вышеизложенным был предложен экспериментальный протокол для изучения эффективности природной кормовой добавки на основе бетулина при скармливании телятам и коровам в период лактации. Критерием оценки выступили изменения параметров естественной резистентности на примере бактерицидной и лизоцимной активности крови.
Цель настоящего исследования — оценка воздействия бетулиносодержащей кормовой добавки на неспецифические факторы гуморального иммунитета — лизоцимную и бактерицидную активность сыворотки крови у телят и коров молочного стада в условиях промышленного животноводческого комплекса.
В задачи исследования входили:
- Количественное определение динамики лизоцимной активности сыворотки крови.
- Оценка изменений бактерицидной активности сыворотки крови у телят и лактирующих коров на фоне пероральной аппликации бетулинсодержащей добавки.
- Проведение сравнительного анализа иммунобиологических показателей между опытной и контрольной группами.
Материалы и методы исследования
Исследования проводили с сентября по октябрь 2024 года на молочных комплексах племенного хозяйства СХП «Колхоз “Сознательный”» (Зубцовский р-н, Тверская обл., Россия) и на базе лаборатории микробиологии Федерального исследовательского центра животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста (Московская обл.).
Хозяйство благополучно по лейкозу, туберкулезу, бруцеллезу.
Для экспериментальных исследований предприятием были выделены животные разных физиологических групп: бычки 5- и 10-месячного возраста и лактирующие коровы сычевской породы 2-й и 3-й лактаций.
Телята (бычки) находились в беспривязном содержании в отдельном комплексе — по 10 голов в секторе, коровы — по принципу привязного содержания в отдельном комплексе на 200 голов.
Условия содержания животных соответствовали ветеринарно-санитарным и гигиеническим требованиям по содержанию помещений и территорий.
При кормлении бычков и коров 2–3-й лактаций использовали рационы, в состав которых входили сено разнотравное луговое (42,4–43,2%), силос кукурузный (17,6–18,9%), зерновая смесь дробленная (пшеница или ячмень) (38,2–39,0%).
Рационы для животных были сформированы по потребности в питательных веществах и энергии.
Для изучения действия бетулина на лизоцимную и бактерицидную активность сыворотки крови телят и коров дойного стадабыли сформированы: 2 группы бычков (опытная и контрольная — по 10 голов в каждой) возраста 5 месяцев с живой массой 150–165 кг; 2 группы бычков (опытная и контрольная — по 10 голов в каждой) возраста 10 месяцев с живой массой 286–316 кг; 2 группы лактирующих здоровых коров 2–3-й лактаций (опытная и контрольная — по 10 голов в каждой) с живой массой 550–600 кг и удоем 7000–8000 в год.
С опытными и контрольными животными проводили все плановые диагностические мероприятия согласно утвержденной схеме лечебно-профилактических обработок в хозяйстве.
Все эксперименты на животных были выполнены с соблюдением этических норм, соответствующих Директиве Европейского союза № 2010/63/ЕС и принципам гуманного обращения с животными, изложенным в статье 4 Федерального закона РФ № 498-ФЗ.
При проведении исследований были предприняты меры, чтобы свести к минимуму страдания животных и количество исследованных опытных образцов.
Добавку, содержащую бетулин (с маркировкой ИП «Иванов Сергей Олегович», ТУ 10.89.15-008-2003838090-2022), в виде водной взвеси в 2%-ном растворе кукурузного крахмала для улучшения биодоступности препарата (далее — бетулиносодержащая добавка) задавали индивидуально каждому животному опытных групп перорально с помощью резиновой бутылки в дозе 10 мг/кг живой массы тела один раз в день в течение 14 дней. Расчет дозы осуществляли, опираясь на ранее проведенные научные исследования.
В начале исследования, а также ежедневно на протяжении 14 суток совместно со специалистами предприятия оценивали клиническое состояние животных: температуру, пульс, дыхание, поведенческие реакции, аппетит, акт дефекации и диурез, двигательную активность, состояние кожных покровов.
В период проведения эксперимента у животных опытных групп не отмечено достоверных изменений показателей температуры тела, частоты пульса и количества дыхательных движений. Не было выявлено общей реакции организма на введение препарата. Не отмечали изменений поведенческих реакций, понижения аппетита, расстройства дефекации и диуреза, а также снижения удоев.
Кровь у животных брали из яремной и подхвостовой вен до и после 14 дней использования добавки с бетулином. Далее получали сыворотку на кафедре диагностики болезней, терапии, акушерства и репродукции животных Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии — МВА им. К.И. Скрябина.
Определение лизоцимной и бактерицидной активности сыворотки крови проводили с использованием 96-луночного микробиологического анализатора Multiskan FC (Thermo Scientific, США).
Для определения процента лизиса, количества лизоцима (мкг) в 1 мл сыворотки крови, удельной единицы активности (ед. а.) в пересчете на 1 мг белка использовали музейный тест-штамм Micrococcus luteus (lysodeicticus) 4698 АТСС 1537 АТСС-2665 с OD540 0,6–0,62 McF («МакФарланда») — предоставлен из коллекции Федерального исследовательского центра, животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста (Московская обл.).
В каждую лунку вносили 0,05 мл исследуемой сыворотки крови, 0,2 мл фосфатного буфера и 0,1 мл стандартной культуры. Термостатировали на термостате DSI-200D (DIGI System, Тайвань) при 37 ºС с определением OD через 1 и 3 часа.
Количество лизоцима в 1 мл сыворотки крови определяли по калибровочной кривой, построенной по стандартному раствору лизоцима. Пересчет уровня лизоцимной активности ферментов в единицы активности на 1 мг белка выражали в условных единицах активности на 1 мг белка (уд. е. а. / мг белка).
Для оценки активности сыворотки крови (БАСК) готовили суспензию суточной музейной тест-культуры Escherichia coli М-17-02 с оптической плотностью 1,9 McF — предоставлен из коллекции Федерального исследовательского центра животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста (Московская обл.). В 96-луночные планшеты разливали по 0,2 мл мясо-пептонного бульона и вносили по 0,05 мл испытуемой сыворотки крови и 0,1 мл инокулюма культуры Escherichia coli М-17-02. Термостатировали на термостате DSI-200D (DIGI System, Тайвань) при 37 ºС 5 часов.
Измерения проводили сразу и через 5 часов культивирования.
Обработка экспериментальных данных выполнена с использованием методов биометрии и компьютерной программы Microsoft Office Excel (США) пакета «Анализ данных».
Результаты и обсуждение
Ранее авторами были получены результаты биохимического анализа крови животных в эксперименте.
Результаты определения количества лизоцима в сыворотке крови и бактерицидной активности сыворотки крови бактерицидной активности у телят и коров до и через 14 дней после применения бетулиносодержащей добавки представлены в виде таблиц.
Из таблицы 1 видно, что пероральное введение добавки 5-месячным телятам на основе бетулина имеет достоверное повышение уровня лизоцима и БАСК в сыворотке крови телят (р ≤ 0,05). В контрольной группе значимых изменений не было выявлено. Из этого следует, что бетулиносодержащая кормовая добавка способствует усилению неспецифического иммунитета у телят.
В таблице 2 показано, что кормовая добавка на основе бетулина достоверно повышает уровень лизоцима и БАСК у телят (р ≤ 0,05) в возрасте 10 месяцев. В контрольной группе изменений по данному показателю не наблюдали. Различия между группами статистически значимы (р ≤ 0,01), что подтверждает иммуномодулирующий эффект добавки.
После применения кормовой добавки, содержащей бетулин, как показано в таблице 3, у коров опытной группы наблюдалось достоверное повышение уровня лизоцима и БАСК (p ≤ 0,05), а в контрольной группе значимых изменений не было обнаружено.
В начале эксперимента показатели количества лизоцима и БАСК у 5-, 10-месячных телят и коров между опытными и контрольными группами статистически достоверных различий не имели.
Средние значения количества лизоцима в опытной группе 5- и 10-месячных телят были ниже, чем в контроле (0,168 ± 0,05 в опыте против 0,219 ± 0,07 в контроле у 5-месячных телят и 0,173 ± 0,05 в опыте против 0,194 ± 0,06 в контроле у 10-месячных телят, а у коров значение 0,216 ± 0,03 в опыте против 0,204 ± 0,05 в контроле, что, однако, подтверждает различие между опытной и контрольной группами статистически недостоверным, оценивали по критерию Стьюдента).
При этом следует отметить, что по клиническим показателям, значениям температуры, пульса, дыхания, живой массе, а также результатам гематологических и биохимических исследований между опытными и контрольными группами в начале эксперимента существенных различий не было.
Спустя 14 дней после дачи бетулиносодержащей кормовой добавки отмечали повышение количества лизоцима сыворотки крови во всех опытных группах животных (р ≤ 0,05). При этом у животных контрольных групп содержание лизоцима сыворотки крови к концу эксперимента оставалось на прежнем уровне.
Несмотря на то что в начале эксперимента значение лизоцима у телят опытной группы было ниже, чем в контроле, на 30% у 5-месячных и на 12% у 10-месячных, сравнение конечного результата между опытными и контрольными группами спустя 14 дней эксперимента показало, что содержание лизоцима у 5-месячных телят опытной группы было больше, чем в контроле на 18,5% (р ≤ 0,01), у 10-месячных телят опытной группы было больше контроля на 23% (р ≤ 0,01), а у коров опытной группы на 35% (р ≤ 0,05) превышало значение содержания лизоцима сыворотки крови коров контрольной группы.
Результаты исследования изменения БАСК телят и коров с применением бетулиносодержащей кормовой добавки коррелировали с результатами определения содержания лизоцима сыворотки крови. Так, у 5-месячных телят опытной группы через 14 дней после дачи бетулиносодержащей кормовой добавки значение БАСК увеличилось с 36,94±3,53 до 48,36±6,5% (р ≤ 0,05).
Аналогичные изменения бактерицидной активности сыворотки крови наблюдали и у телят 10-месячного возраста и коров. В то же время у животных контрольных групп БАСК к концу опыта оставалась на прежнем уровне.
Выводы
На основании проведенных исследований установлено, что пероральное применение бетулиносодержащей кормовой добавки вызывает статистически достоверное (при p ≤ 0,01) повышение уровня лизоцима (на 64,3%) у 5-месячных телят, на 51,4% — у 10-месячных, а также увеличение бактерицидной активности сыворотки крови на 30,9% и 40,1%, соответственно, по сравнению с контрольными группами.
У лактирующих коров опытной группы зафиксирован рост лизоцимной активности на 50,5% и увеличение БАСК на 47,5% относительно исходных значений, в то время как в контрольной группе изменения показателей не превышали 3,2%.
Полученные количественные данные демонстрируют выраженную динамику изученных иммунологических параметров, достигающую максимальной значимости при p ≤ 0,01. Выявленная положительная динамика неспецифических факторов гуморального иммунитета свидетельствует о наличии выраженного иммуномодулирующего действия изучаемой добавки.
Таким образом, применение бетулина способствует статистически значимому усилению естественной резистентности организма животных, что подтверждается активацией как лизоцимной, так и бактерицидной системы сыворотки крови с максимальной эффективностью у 10-месячных телят.
Об авторах
Лариса Александровна Гнездилова, доктор ветеринарных наук, профессор, заведующая кафедрой диагностики болезней, терапии, акушерства и репродукции животных
lag22004@mail.ru https://orcid. org: 0000-0003-1007-34
Жора Юрикович Мурадян, кандидат биологических наук, доцент
zh_muradyan@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-2516-7627
Юлия Сабировна Круглова, кандидат ветеринарных наук, доцент
y7272@mail.ru https://orcid.org/:0000-0003-2953-0745
Серафим Михайлович Розинский, ассистент кафедры диагностики болезней, терапии, акушерства и репродукции животных
ser.roz1@yandex.ru https://orcid.org/:0009-0001-1937-6919
Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии — МВА им. К.И. Скрябина, ул. Академика Скрябина, 23, Москва, 109472, Россия
УДК 619:616.9:636.088:636.4
DOI: 10.32634/0869-8155-2025-398-09-30-37
