Изучение биоэквивалентности лекарственных препаратов для ветеринарного применения «Авекардит» и «Ветмедин S» в организме собак
В настоящее время ветеринарная фармацевтическая наука в первую очередь нацелена на непрерывный поиск новых перспективных соединений с высокой фармакологической активностью и заданными фармакодинамическими и фармакокинетическими свойствами. Как правило, этот путь очень длительный и занимает многие годы, поэтому для быстрого вывода на рынок уже известных и высокоэффективных молекул, особенно в рамках импортозамещения, используются подход создания отечественной лекарственной формы (дженерика) и подтверждение его эффективности и безопасности на основании изучения биоэквивалентности в сравнении с референтным препаратом, уже зарегистрированным в России. Соответствие воспроизведенных лекарственных средств оригинальному препарату доказывают прежде всего на основании фармацевтической и фармакокинетической эквивалентности по ряду фармакокинетических параметров действующих веществ препаратов, таких как уровень и скорость всасывания, распределения и выведения из организма.
В ветеринарной терапевтической практике для лечения кардиопатологий у мелких домашних животных широко востребованы препараты на основе пимобендана. Это связано с положительным ионотропным (увеличение силы сердечных сокращений) и вазодилатирующим (сосудорасширяющим) действием пимобендана. Пимобендан — производное бензимидазол-пиридазинона, в организме метаболизируется до о-десметил-пимобендана.
Согласно литературным данным, у собак пимобендан проявляет положительные ионотропные и вазодилатирующие свойства через 1 ч. после приема внутрь, в то время как о-десметил-пимобендан оказывает сердечно-сосудистое действие в течение 8–12 ч. после введения. Положительный инотропный эффект действующего вещества обусловлен повышением чувствительности волокон сердечной мышцы к кальцию, а вазодилатирующий эффект связан с ингибированием активности фосфодиэстеразы III.
Анализ результатов клинических исследований показал, что применение препаратов на основе пимобендана обладает рядом преимуществ по сравнению с другими методами лечения по уровню эффективности и отсутствию побочных эффектов. Назначение пимобендана в составе терапии значительно улучшает качество и продолжительность жизни собак с наследственными, а также приобретенными кардиологическими патологиями.
К числу препаратов на основе пимобендана относят разработанный в Российской фармацевтической компании ООО «ВИК — здоровье животных» лекарственный препарат «Авекардит» (далее — воспроизведенный препарат), а также препарат «Ветмедин S», (далее — референтный препарат), производимый компанией Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH (Германия). Препараты «Авекардит» и «Ветмедин S» применяют собакам для лечения сердечной недостаточности, вызванной дилатационной кардиомиопатией, недостаточностью двух- или трехстворчатого клапана, с выраженными клиническими проявлениями: кашлем, одышкой, обмороками, понижением активности, непереносимостью физических нагрузок или асцитом.
Референтный и воспроизведенный препараты выпускают в форме таблеток. Препараты «Ветмедин S» и «Авекардит» в зависимости от массы таблетки содержат в качестве действующего вещества 1,25 мг, 5 мг и 10 мг пимобендана.
Ввиду того что целевым видом для данных лекарственных препаратов являются собаки, изучение фармакокинетической биоэквивалентности препаратов «Ветмедин S» и «Авекардит» было проведено на этой целевой группе животных.
Материалы и методы исследования
Эксперимент был проведен на 7 клинически здоровых собаках-метисах (1 сука, 6 кобелей) возраста 2–3 года массой 21,4–25 кг. За 15 дней до и во время опыта собаки не получали никаких лекарственных средств, кроме исследуемых препаратов. За 8 часов до введения препаратов и в течение 2 ч. после введения животным ограничивали доступ к корму, воду собаки получали вволю. Во время исследования соблюдали принципы гуманного отношения к экспериментальным животным.
Для эксперимента был применен последовательный дизайн исследований, что соответствует требованиям законодательства в части исследования биоэквивалентности.
Препараты вводили собакам пероральным путем, однократно, индивидуально в максимальной терапевтической дозе — 0,6 мг пимобендана на 1 кг массы животного. Интервал между введениями референтного и воспроизведенного лекарственных препаратов животным составлял 48 ч. Выбор такого промежутка времени был обусловлен требованиями нормативного документа, регламентирующего правила проведения исследований биоэквивалентности.
Согласно этим правилам, период между введениями референтного и воспроизведенного препаратов группе животных должен быть не менее шестикратного периода полувыведения действующего вещества и его метаболитов. В случае с пимобенданом: период его полувыведения из организма животных не превышает 2 ч. Таким образом, временной промежуток между введениями препаратов «Авекардит» и «Ветмедин S» при применении последовательного дизайна не должен быть меньше 12 ч.
Отбор крови проводили до введения препаратов и через 10, 20, 40 мин.; 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 6, 8, 10, 12 и 24 ч. — после введения. Образцы отбирали в промаркированные одноразовые пробирки с активатором свертывания. Сразу после получения кровь центрифугировали и отделяли сыворотку. В биоаналитическую лабораторию «Биовизор» (г. Москва) сыворотку транспортировали в термоконтейнере. Образцы сыворотки крови собак до анализа хранили в замороженном виде в промаркированных шифром пробы пробирках типа Eppendorf при температуре минус 20 ± 4 °С.
В процессе исследования определяли концентрации действующего вещества препаратов и его метаболита в сыворотке крови собак. На основании полученных результатов осуществляли расчет фармакокинетических параметров действующего вещества в организме собак и производили оценку биоэквивалентности препаратов. В исследовании использовали стандартные образцы пимобендана CAS Number: 74150-27-9, кат. № P447500, чистота 99,03% (TRC Canada), о-десметил-пимобендана, CAS Number: 108381-22-2, чистота 92,56 (Россия). В качестве внутреннего стандарта при определении пимобендана и его метаболита использовали стандартный образец фенбендазола сульфона CAS Number: 54029-20-8, кат. № 32544, чистота 99,9% (Sigma Aldrich).
Для проведения операций пробоподготовки использовали химические реактивы квалификации «хч» и «осч», для выполнения хромато-масс-спектрометрического анализа — органические растворители квалификации «для LCMS» и деионизированную воду, полученную с помощью системы очистки воды Millipore Direct-Q 5 UV Smart (Франция).
Концентрацию пимобендана и о-десметил-пимобендана определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием на хромато-масс-спектрометре Shimadzu LCMS-8060 (Япония). Использованный в работе метод анализа был валидирован согласно требованиям международных нормативных документов. Методика была валидирована по показателям: линейность, матричный эффект, степень извлечения, специфичность, селективность, эффект переноса, прецизионность, правильность, наименьший предел количественного определения, допустимость разбавления, стабильность аналитов и внутреннего стандарта.
Полученные концентрации пимобендана и о-десметил-пимобендана в сыворотке крови собак использовали для расчета их фармакокинетических параметров: период полувыведения действующего вещества (T1/2), максимальную концентрацию действующего вещества(Cmax), площадь под кривой «концентрация действующего вещества — время» в интервале времени от 0 до момента (t) отбора последней пробы биоматериала (AUC0-t), площадь под кривой «концентрация действующего вещества –— время» в интервале времени от 0 до ∞ (AUC0-∞), среднее время удержания вещества в системном кровотоке (MRT), соотношение AUC0-t/AUC0-∞.
Наличие (отсутствие) биоэквивалентности между воспроизведенным препаратом и референтным препаратом, отобранным для исследований по лекарственной форме и содержанию действующего вещества, оценивали в соответствии с Правилами проведения исследований биоэквивалентности лекарственных средств Евразийского экономического союза. Биоэквивалентность препаратов оценивали на основе предположения о логнормальном распределении измеренных величин Cmax, AUC(0-t), AUC(0-∞) и Cmax/AUC(0-t). Диапазон линейности методики соответствовал диапазонам концентраций действующего вещества и его метаболита в сыворотке крови собак после введения воспроизведенного и референтного препаратов. Статистическую обработку полученных индивидуальных данных проводили стандартными методами с использованием программного обеспечения Microsoft Excel (США). Расчеты фармакокинетических параметров были выполнены с использованием ПО PKSolver 2.0 (надстройка для Microsoft Excel) с применением некомпартментальной (бескамерной) модели распределения действующего вещества исследуемых препаратов. Рисунки были выполнены с использованием программ Shimadzu LabSolutions (Realtime Analysis, Postrun Analysis, Quant Browser) v.5.99 SP2 и Microsoft Excel.
Результаты и обсуждение
На основании полученных данных установлено, что пимобендан быстро всасывается и обнаруживается в сыворотке крови собак спустя 10 мин. у всех собак после введения референтного препарата и у большинства животных, которым вводили воспроизведенный препарат.
Tmax пимобендана для референтного препарата составила от 1 до 1,5 ч. после введения, при этом максимальные концентрации пимобендана находились в диапазоне 49,956–61,108 нг/мл. Далее его содержание в сыворотке крови собак постепенно снижалось, и спустя 8 ч. у всех испытуемых животных было ниже предела количественного определения методики (1 нг/мл) (НПКО).
Для воспроизведенного препарата «Авекардит» пик концентрации пимобендана в крови был достигнут через 0,67–1 ч. Максимальные концентрации пимобендана находились в диапазоне 53,995–62,873 нг/мл. В дальнейшем содержание пимобендана в сыворотке крови уменьшалось. Так, концентрации пимобендана не превышали НПКО методики через 6 ч. у 4 собак, у 2 собак — через 8 ч.
График изменения концентраций пимобендана в сыворотке крови собак представлен на рисунке 1.
Полученные значения концентрации пимобендана в сыворотке крови позволили рассчитать его фармакокинетические параметры, которые представлены в таблице 1.
В ходе исследования были получены данные о том, что пимобендан метаболизируется до о-десметил-пимобендана. Для воспроизведенного препарата «Авекардит» в сыворотке крови собак максимальные концентрации о-десметил-пимобендана были отмечены через 1–1,5 ч. после введения и находились в диапазоне 47,245–60,327 нг/мл. Снижение концентрации более чем в 2 раза отмечено к 2,5–4 ч. после введения препарата. Далее содержание аналита снижалось, и к 10–24 ч. концентрация метаболита не превышала НПКО.
После введения референтного препарата максимальные концентрации о-десметил-пимобендана наблюдали через 1–2 ч. в диапазоне 45,193–64,855 нг/мл. К 8 часам концентрация снижалась до уровня 1,955–4,173 нг/мл, а к 10–24 ч. не превышала НПКО (рис. 2).
На основании значений концентраций о-десметил-пимобендана в сыворотке крови собак были рассчитаны его фармакокинетические параметры, которые представлены в таблице 2.
Значения Cmax и AUC(0-t), полученные при фармакокинетическом анализе, были подвергнуты логарифмическому преобразованию. Оценка нормальности распределения значений показала, что параметры Cmax и AUC(0-t) характеризуются логнормальным распределением (p > 0,05).
Полученные фармакокинетические величины подвергали статистическому анализу (однократный дисперсный анализ, ANOVA) с оценкой влияния периода и последовательности расчетом среднеквадратической ошибки и расчетом 90% доверительного интервала для отношения максимальных концентраций исследуемого и референтного препаратов (CmaxT/CmaxR) и отношения площадей под фармакокинетическими кривыми исследуемого и референтного препаратов (AUC(0-t)T/AUC(0-t)R).
Результаты вычисления доверительных интервалов для отношений фармакокинетических параметров пимобендана и о-десметил-пимобендана представлены в таблицах 3, 4.
Полученные результаты свидетельствовали о том, что 90% доверительные интервалы для отношений Cmax и AUC0-t пимобендана и о-десметил-пимобендана находятся в пределах диапазона 80–125, и, следовательно, гипотеза о биоэквивалентности препаратов «Ветмедин S» и «Авекардит» принимается.
Выводы
Результаты изучения сравнительной фармакокинетики воспроизведенного препарата «Авекардит» и референтного препарата «Ветмедин S» в организме собак продемонстрировали, что они являются фармацевтически эквивалентными. Доказательством послужило то, что двусторонние доверительные интервалы для отношений Cmax, AUC0-t находились в диапазоне 80–125%.
Итогом проведенных исследований служит вывод о сопоставимости фармакокинетического профиля препарата для собак «Авекардит» с аналогичными значениями фармакокинетических параметров препарата «Ветмедин S», который ранее был зарегистрирован в РФ на основании результатов доклинических и клинических исследований, подтвердивших его качество, эффективность и безопасность. Таким образом, результаты полученных исследований продемонстрировали наличие достаточных оснований для признания безопасности и эквивалентной терапевтической активности разработанного в РФ препарата «Авекардит» и дальнейшей его апробации в ветеринарной практике.
Об авторах
Сергей Владиславович Абрамов1; кандидат ветеринарных наук
120.net@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-9445-4577
Андрей Владимирович Балышев2; кандидат биологических наук
bav898@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-9186-2671
Вячеслав Викторович Головин; кандидат биологических наук
v.golovin@biovizor.ru; https://orcid.org/0009-0001-5123-9068
Павел Павлович Кочетков1; Руководитель лаборатории
kochetkov@biovizor.ru; https://orcid.org/0000-0001-6688-5540
Борис Викторович Виолин3; кандидат ветеринарных наук
b_viol@yahoo.com
1ООО «Биовизор», ул. Нагорная, 3А, Москва, 117186, Россия
2Поволжский научно-исследовательский институт производства и переработки мясомолочной продукции, ул. им. Рокоссовского, 6, Волгоград, 400131, Россия
3Федеральный научный центр — Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук, Рязанский пр-т, 24, корп. 1, Москва, 109428, Россия
УДК 619:615.033
DOI: 10.32634/0869-8155-2024-383-6-33-38
