Исследование влияния липофильных криофракций селезенки и плаценты крупного рогатого скота на мышей в условиях генотоксического действия митомицина
Видовые, породные и линейные признаки животных передаются из поколения в поколение благодаря материальным носителям наследования — хромосомам, состоящим из ДНК и гистонов. Диплоидные соматические клетки содержат полный, стабильный и специфичный для данного вида объем информации и обеспечивают полноценное функционирование систем животного организма. Ряд экзогенных и эндогенных факторов способен приводить к нарушению количества и структуры хромосом, разрыву ДНК, потере или изменению кодированной в ней информации. Среди основных эндогенных факторов, влияющих на целостность клеточного генома, выделяют воздействие активных форм кислорода и других токсических молекул, образующихся в процессе метаболизма, ошибки деления клеток или копирования и репарации ДНК, а также несвоевременную элиминацию поврежденных клеток. Так, самцы сельскохозяйственных животных могут иметь сниженную фертильность в связи с наличием в эякуляте сперматозоидов, находящихся в стадии «абортивного» (не завершенного) апоптоза, сперматозоидов с аберрантным хроматином, возникающим из-за ошибок в его компактизации, и сперматозоидов с поврежденной ядерной и митохондриальной ДНК, укороченными теломерами, эпигенетическими изменениями и микроделециями Y-хромосомы, которые возникают в результате окислительного стресса. Среди экзогенных факторов повреждения генома выделяют генотоксическое действие ксенобиотиков (лекарственные средства, тяжелые металлы, отходы производств, пестициды, инсектициды, микотоксины, бактериальные токсины и другие соединения), повышенную температуру, ионизирующую радиацию, инфекционные заболевания. Воздействие этих факторов способно либо прямо индуцировать повреждение ДНК и нарушения клеточного деления, либо косвенно увеличивать частоту повреждений с помощью механизмов, сходных с действием эндогенных факторов. Так, например, показано увеличение числа хромосомных аберраций в лимфоцитах крови коров под действием диоксинов, а микотоксин (охратоксин А) индуцировал повреждение ДНК в эмбрионах свиней.
Таким образом, влияние ряда неблагоприятных факторов, а также некоторые заболевания способны индуцировать повреждение генетического аппарата в клетках, что может инициировать развитие патологий в организме сельскохозяйственных животных и их потомства. Эти факторы в конечном итоге приводят к экономическим потерям для сельскохозяйственных производителей. Сохранение и поддержание целостности генофонда сельскохозяйственных животных является актуальной проблемой современного животноводства.
Поэтому большую значимость приобретает поиск природных антимутагенов, способных предотвратить вредное действие мутагенных факторов, а также способов их применения. Введение веществ, обладающих антимутагенным действием, способно снизить повреждение ДНК, хромосом и тем самым способствовать сохранению цитогенетической стабильности организма животных.
Благодаря наличию разнообразных биологических эффектов внимание исследователей привлекают препараты, содержащие в своем составе фракции селезенки, плаценты или крови крупного рогатого скота или свиней. Вместе с тем способ получения фармацевтических субстанций, его характеристики могут оказывать влияние на ее действие. Липофильные формы фармацевтических препаратов тканевого происхождения могут быть обогащены жирорастворимыми гормонами, витаминами и другими физиологически активными веществами. Однако их свойства изучены недостаточно.
Поэтому цель данной работы — выявление антимутагенных и ДНК-защитных свойств липофильных криофракций некоторых органов крупного рогатого скота у мышей в условиях индуцированной митомицином генотоксичности.
Материалы и методы исследований
Исследования были выполнены в 2024 году. Используя метод криофракционирования, в лаборатории доклинических исследований и моделирования биологических систем и вивария ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии» (ФГБНУ «ВНИВИПФиТ», Россия) были изготовлены:
а) липофильная криофракция селезенки крупного рогатого скота (ЛКСК);
б) липофильная криофракция плаценты крупного рогатого скота (ЛКПК);
в) смесь липофильной криофракции селезенки и плаценты крупного рогатого скота в соотношении 1:1 (ЛКСПК).
Для индукции генотоксического действия применяли «Митомицин-С Киова» (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd, Япония), содержащий в качестве действующего вещества митомицин (ММ).
В экспериментах использовали самцов белых беспородных мышей (Mus albus officinarum, n = 66) массой тела 26,0 ± 2,0 г, полученных из вивария ФГБНУ «ВНИВИПФиТ».
Подопытные животные содержались в стандартных условиях вивария (температура воздуха +18‒23 °C, относительная влажность 45‒60%). Доступ к воде и корму был свободным.
Предварительно на заседании биоэтической комиссии ФГБНУ «ВНИВИПФиТ» (протокол № 1-01/24 от 25 января 2024 года) было получено одобрение на все предлагаемые в эксперименте процедуры с животными, которые также соответствовали Директиве 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22 сентября 2010 года по охране животных, используемых в научных целях.
В ходе эксперимента были сформированы группы подопытных животных (табл. 1). В каждой группе исследовали по 6 животных. Мышей выводили из эксперимента путем передозировки углекислого газа через 24 ч после окончания инъекций. Из бедренных костей животных вымывали костный мозг и готовили его суспензию в буферном растворе Хенкса (pH 7,4), а также получали образцы печени для выделения тотальной ДНК.
Выбор дозы вводимой фармацевтической субстанции был обусловлен проведенными ранее исследованиями и соответствовал условно-терапевтическим дозам исследуемых фармацевтических субстанций и содержащих их препаратов, которые применялись для продуктивных животных. Доза ММ 10 мг/кг была достаточной для индукции генотоксичности в клетках костного мозга и печени мышей исследуемых групп.
Микроядерный тест проводили путем микроскопирования с помощью микроскопа «Микромед-3 ЛЮМ» («Микромед», Китай) при увеличении ×1000 препаратов костного мозга мышей, окрашенных по Романовскому — Гимзе. Определяли частоту полихроматофильных эритроцитов с микроядрами (МЯПХЭ) и долю полихроматофильных эритроцитов (ПХЭ) относительно нормохромных эритроцитов (НЭ). Об антимутагенном эффекте судили по статистически значимому снижению частоты МЯПХЭ у исследуемых групп относительно частоты МЯПХЭ в костном мозге мышей группы позитивного контроля (мыши получали только ММ).
Исследование повреждения митохондриальной ДНК (мтДНК) проводили с помощью количественной полимеразной цепной реакции (qPCR) длинных цепей. Амплификацию проводили с использованием амплификатора DTlite 4 («ДНК-технология», Россия). Для измерения количества копий мтДНК использовали фрагмент мтДНК, кодирующий гены 16S и Nd1 (16S-Nd1) и ядерный ген gapdh в качестве референса. Величину повреждения митохондриальной ДНК (мтДНК) определяли относительно группы I c помощью qPCR путем изучения участка мтДНК, кодирующего 12S и 16S рРНК (12S‒16S), и участка, кодирующего митохондриальный ген ND5 (ND5) с использованием опубликованных ранее праймеров. Исследовали по четыре животных в группе.
Статистическую обработку данных проводили с помощью пакетов программы STATISTICA 10 (Statsoft, США). Сравнение выборок осуществляли с использованием U-теста Манна — Уитни. Полученные результаты представляли как среднее арифметическое (M) ± стандартная ошибка (SE).
Результаты и обсуждение
В исследовании нами была изучена частота МЯПХЭ при однократном и курсовом введении липофильных криофракций селезенки и плаценты КРС (ЛКСК, ЛКПК, ЛКСПК) совместно с ММ (рис. 2). Введение липофильных криофракций селезенки и плаценты КРС (группы IIa, IIb, IIc) не вызывало изменения частоты МЯПХЭ в костном мозге относительно группы негативного контроля. Так, частота МЯПХЭ составила 0,53 ± 0,13; 0,59 ± 0,10; 0,52 ± 0,12; 0,55 ± 0,18% у групп I, IIa, IIb, IIc соответственно.
Нами было обнаружено увеличение частоты МЯПХЭ в костном мозге в 12,6 раз (p < 0,05) до 6,7% относительно группы I при введении мышам ММ (группа V). Однако введение ЛКСК (группа IIIa) снижало частоту МЯПХЭ в 4,1 раза (полученное значение: 1,62 ± 0,47%) относительно группы позитивного контроля (группа V). Однократное введение ЛКПК (группа IIIb) снижало частоту МЯПХЭ в 3,9 раза: до 1,87 ± 0,26% (p < 0,05), а применение ЛКСПК (группа IIIc) — в 2,4 раза: до 2,73 ± 0,51% (p < 0,05) относительно группы V.
При трехкратном введении перед инъекцией ММ фармацевтических субстанций: ЛКСК, ЛКПК, ЛКСПК (частота МЯПХЭ составила 5,67 ± 0,91; 5,40 ± 0,39; 4,60 ± 0,67% в группах IVa, IVb и IVc соответственно), было выявлено статистически значимое снижение частоты МЯПХЭ в костном мозге у группы IVc (ЛКСПК) на 31,3% (p < 0,05) относительно группы V.
В группах IIa, IIb, IIc применение ЛКСК, ЛКПК и ЛКСПК не вызывало изменений доли ПХЭ относительно группы негативного контроля (группа I), которая составляла 46,79 ± 2,57; 47,87 ± 1,54; 49,51 ± 1,66 и 49,62 ± 2,04 соответственно. Введение липофильных криофракций совместно с ММ достоверно снижало токсический эффект ММ на гемопоэтические клетки костного мозга. Так, при однократном введении ЛКСК, ЛКПК, ЛКСПК совместно с митомицином (группы IIIa, IIIb, IIIc) доля ПХЭ составляла 44,73 ± 4,03; 37,47 ± 2,68; 38,69 ± 1,99% соответственно. При этом содержание ПХЭ при введении ЛКСК (группа IIIa) относительно группы I снижалась незначимо, а в группах IIIb и IIIc была меньше на 24,0 и 24,5% (p < 0,05) соответственно.
В то же время нами обнаружено достоверное увеличение доли ПХЭ во всех трех группах относительно мышей, получивших только ММ (группа V), содержание которых составляло 31,55 ± 1,60%. Так, в группах IIIa, IIIb и IIIc наблюдалось возрастание содержания ПХЭ в костном мозге на 22,6; 19,0 и 19,5% (p < 0,05) соответственно.
Многократное введение липофильных криофракций совместно с ММ приводило к сходному тренду изменений исследуемых показателей. Доля ПХЭ в костном мозге в группах IVa, IVb и IVc составляла 44,56 ± 1,83; 40,89 ± 3,21 и 40,67 ± 2,43% соответственно. При этом, как и при однократном введении, трехкратное введение ЛКСК (группа IVa) не приводило к достоверному изменению содержания ПХЭ относительно группы I, а в группах IVb и IVc индуцировано снижение доли ПХЭ на 17,6 и 18,0% соответственно. Помимо этого, курсовое применение ЛКСК и ЛКСПК (группы IVa и IVc) приводило к возрастанию доли ПХЭ на 41,2 и 28,9% относительно группы V.
Таким образом, нами было выявлено снижение токсического действия ММ в группах IIIa, IIIb, IIIc и IVa, IVc.
Далее определяли относительное число копий мтДНК и количество повреждений в мтДНК в печени мышей, которым вводили ЛКСК, ЛКПК и ЛКСПК (рис. 2). Уровень митохондриального биогенеза, несмотря на колебания в исследуемых группах (группы II‒V) значимо не отличался от уровня негативного контроля (группа I), который составлял 1,08 ± 0,30. Отдельное введение липофильных субстанций (группы IIa, IIb и IIc) не вызывало значимого увеличения количества повреждений мтДНК в печени мышей, во фрагменте 12S‒16S оно было равным 0,45 ± 1,67; 0,65 ± 1,36 и 0,81 ± 0,64, а во фрагменте ND5 — 1,46 ± 0,64; 1,93 ± 9,58 и 1,67 ± 0,67 соответственно.
После совместного однократного введения ЛКСК, ЛКПК и ЛКСПК с ММ (группы IIIa, IIIb и IIIc) обнаружено увеличение количества повреждений мтДНК. Так, во фрагменте 12S‒16S количество повреждений составило 1,88 ± 2,04; 3,98 ± 0,27 и 1,3 ± 0,91, а во фрагменте ND5 — 2,35 ± 0,49; 3,54 ± 0,29 и 3,10 ± 0,36 у групп IIIa, IIIb и IIIc соответственно. Вместе с тем в группе IIIa в обоих фрагментах количество повреждений мтДНК достоверно не отличалось от показателей негативного контроля (группа I). В то же время количество повреждений мтДНК в группе IIIb было в 4 и 3,5 раза выше (p < 0,05) во фрагментах 12S‒16S и ND5 относительно группы I. В группе IIIc только во фрагменте ND5 нами обнаруженодостоверное увеличение количества повреждений мтДНК в 3,1 раза. Вместе с тем в группах IIIa, IIIb и IIIc количество повреждений мтДНК печени не снижалось относительно группы V. В этой группе количество повреждений мтДНК во фрагментах 12S‒16S и ND5 составило 4,58 ± 0,63 и 3,69 ± 0,27 соответственно.
При курсовом введении липофильных криофракций перед инъекцией ММ количество повреждений мтДНК во фрагменте 12S‒16S составило 0,16 ± 0,67; 1,63 ± 0,75 и 1,45 ± 0,52 для групп IVa, IVb и IVc соответственно, а для фрагмента ND5 — 2,12 ± 0,58; 3,12 ± 0,92 и 1,58 ± 0,63.
Таким образом, нами обнаружено статистически значимое снижение мтДНК при курсовом введении ЛКСК перед ММ (группа IVa) на 96,5 % (p < 0,05) во фрагменте 12S‒16S относительно группы Vd, которое не было выявлено во фрагменте ND5. При курсовом введении ЛКСПК перед ММ (группа IVc) в фрагментах 12S‒16S и ND5 количество повреждений достоверно также снижалось на 68,3 и 57,2% (p < 0,05), соответственно.
В ходе исследования не обнаружено проявление исследуемыми криофракциями селезенки и плаценты мутагенного или токсического действия, которое оценивали по снижению доли полихроматофильных эритроцитов в костном мозге мышей относительно нормохромных эритроцитов. В результате проведенной работы все криофракции селезенки или плаценты достоверно индуцировали снижение частоты МЯПХЭ в костном мозге мышей при индуцированном ММ генотоксическом воздействии. Применение исследуемых фармацевтических субстанций приводило к уменьшению частоты МЯПХЭ в 4,1; 3,9 и 2,4 раза (p < 0,05) соответственно при однократном применении относительно мышей группы позитивного контроля.
Трехкратная инъекция ЛКСПК индуцировала уменьшение частоты МЯПХЭ на 31,3% (p < 0,05) относительно мышей группы V. Таким образом, липофильные криофракции селезенки и плаценты оказывали антимутагенное воздействие на мышей с индуцированной митомицином цитогенетической нестабильностью. Далее с помощью количественной ПЦР нами было проведено исследование копийности митохондриальной ДНК (мтДНК) и относительного количества повреждений мтДНК в печени мышей исследуемых групп. Введение исследуемых фармацевтических субстанций и митомицина статистически значимо не влияло на митохондриальный биогенез. Как и в микроядерном тесте на полихроматофильных эритроцитах костного мозга, при введении фармацевтических субстанций количество повреждений не отличалось от группы негативного контроля. В условиях генотоксического действия митомицина курсовое введение липофильной криофракции селезенки и смеси липофильной криофракции селезенки и плаценты значимо уменьшало количество повреждений мтДНК на 96,5 и 68,3% (p < 0,05) соответственно во фрагменте 12S‒16S относительно группы V. Трехкратная инъекция смеси липофильной криофракции селезенки и плаценты перед инъекцией митомицина также снижало количество повреждений мтДНК на 52,2% (p < 0,05) во фрагменте ND5 относительно животных группы позитивного контроля.
Таким образом, было выявлено ДНК-защитное действие липофильной криофракции селезенки и смеси липофильной криофракции селезенки и плаценты крупного рогатого скота по отношению к мтДНК.
При этом снижение антимутагенного эффекта у липофильных криофракций при курсовом воздействии может быть не только ответной реакцией организма, выражающейся в активации компенсаторных механизмов организма в ответ на введение исследуемых фармацевтических субстанций (изменение всасывания, ускорение биотрансформации и экскреции, снижение чувствительности рецепторов). Эти данные могут являться свидетельством различных механизмов действия криофракций. Так, для веществ, проявляющих свойства дисмутагенов, которые предотвращают попадание генотоксиканта в клетки или непосредственно дезактивируют его, характерно краткосрочное проявление антимутагенных свойств, в то время как свойства биоантимутагенов, которые способны влиять на протекание биохимических процессов в клетках, проявляются скорее при курсовом введении антигенотоксиканта.
Действительно, выявленное увеличение доли ПХЭ в костном мозге при однократном введении липофильных криофракций может свидетельствовать о снижении токсического действия ММ, например, из-за поддержания целостности клеточных мембран, что также является одним из механизмов антигенотоксического действия. Подтверждением этих данных может служить значимое увеличение доли ПХЭ в костном мозге при однократном введении ЛКСК, ЛКПК и ЛКСПК и курсовом приеме ЛКСК и ЛКСПК перед введением ММ. Так, для некоторых фармацевтических субстанций и препаратов, содержащих липофильные экстракты органов животных, показано наличие различных биологически активных веществ, например липофильных витаминов А и Е, которые являются антиоксидантами и способны увеличивать устойчивость клеточных мембран. Вместе с тем одни и те же вещества могут проявлять свое антигенотоксическое действие с помощью различных механизмов.
Это, в некоторой степени, может объяснить то, что, в отличие от однократного применения, только курсовое введение ЛКСК и ЛКСПК вызывало уменьшение количества повреждений мтДНК в печени мышей, индуцированное ММ (рис. 2). При этом следует отметить, что фрагмент 12S‒16S мтДНК показал большую чувствительность к ДНК-защитному действию исследуемых фармацевтических субстанций при введении генотоксиканта — ММ. Количество повреждений мтДНК значимо снижалось на 89,7; 96,5; 68,3% (p < 0,05) при курсовом введении ЛКСК и ЛКСПК соответственно, в то время как число повреждений мтДНК значимо снижалось во фрагменте ND5 на 57,2% только при курсовом введении ЛКСПК. Также следует отметить низкую чувствительность фрагментов 12S‒16S и ND5 мтДНК к генотоксическому действию циклофосфамида в дозе 20 мг/кг. Полученные различия могли проявиться в связи с отличием в типе повреждений мтДНК, различным нуклеотидным составом исследуемых участков мтДНК и активностью кодируемых в них генов. Следует отметить, что, хотя и больший антимутагенный эффект наблюдался нами при введении криофракций селезенки, только сочетание криофракции селезенки и плаценты КРС индуцировало снижение количества повреждений в мтДНК во фрагменте ND5.
Выявленные изменения, вероятно, могут быть вызваны не только прямым антиоксидантным действием витаминов, аминокислот (L-аргинин, цистеин) или других биологически активных молекул (фосфолипиды, глутатион), но и быть индуцированными действием регуляторных молекул, которые были выявлены в различных экстрактах тканей животных. Действительно, гормоны, цитокины, простагландины и другие биологически активные молекулы способны приводить к модуляции антиоксидантной системы, системы интерферонов, систем репарации ДНК, регулировать активность апоптоза, влиять на клеточный цикл, которые прямо или косвенно изменяют мутагенную активность генотоксикантов. Вместе с тем пути и механизмы антимутагенного и ДНК-протекторного действия, которые обнаружены у фармацевтических субстанций тканевого происхождения, до конца не выявлены и требуют дальнейшего изучения.
В ходе исследования при генотоксическом воздействии, вызванном ММ, ЛКСК, ЛКПК и ЛКСПК проявляли антимутагенную активность в костном мозге мышей, которая выражалась в снижении частоты МЯПХЭ, а ЛКСК и ЛКСПК оказывали ДНК-протекторный эффект на мтДНК печени в 12S‒16S и ND5 фрагментах мтДНК.
Выводы
В условиях индуцированной митомицином цитогенетической нестабильности ЛКСК, ЛКПК и ЛКСПК проявляли антимутагенную активность в костном мозге мышей, а ЛКСК и ЛКСПК оказывали ДНК-протекторный эффект на мтДНК печени.
Эти данные свидетельствуют о перспективности использования липофильных криофракций селезенки и плаценты КРС в качестве компонентов препаратов, способствующих поддержанию генетической стабильности генома сельскохозяйственных животных.
Об авторах
Галина Анатольевна Востроилова, доктор биологических наук, главный научный сотрудник
gvostroilova@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-2960-038X
Дмитрий Игоревич Шабанов, научный сотрудник
am7d@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-1574-1317
Нина Алексеевна Хохлова, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник
nina_xoxlova@mail.ru https://orcid.org/0000-0001-6861-2554
Анастасия Андреевна Корчагина, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник
a.a.korch@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-8561-417X
Артём Валерьевич Некрасов, младший научный сотрудник
artem_artem_nekrasov@inbox.ru https://orcid.org/0000-0002-5957-1583
Михаил Юрьевич Сыромятников, кандидат биологических наук, доцент, ведущий научный
сотрудник
mihan.vrn@mail.ru https://orcid.org/0000-0001-9028-0613
Николай Алексеевич Стрельников, младший научный сотрудник
strelnickov.nickolay@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-0781-7713
Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии, ул. им. Ломоносова, 114Б, Воронеж, 394087, Россия
УДК 619:615.36:575.224.46
DOI: 10.32634/0869-8155-2025-398-09-22-29
Просмотров: 117
