Исследование безопасности и пробиотических свойств нормофлоры рода Lactobacillus
Птицеводство в России — одна из ключевых отраслей сельского хозяйства. Играет важную роль в обеспечении продовольственной безопасности и реализации программы импортозамещения. Благодаря коротким срокам производства, высокой рентабельности и доступности продукции оно занимает лидирующую позицию в животноводстве, обеспечивая население мясом птицы и яйцами, которые ценятся за питательные свойства и доступную цену.
Интенсивное применение современных технологий, поддержка государства и высокий экспортный потенциал способствуют динамичному развитию отрасли. При комплексной поддержке и инвестициях птицеводство в России продолжает развиваться, сочетая экономическую выгоду с укреплением продовольственной безопасности.
Пробиотические микроорганизмы являются неотъемлемой частью устойчивого и эффективного птицеводства, способствуя здоровью птиц, повышению продуктивности и экологической безопасности производства. Такие микроорганизмы поддерживают баланс кишечной микрофлоры, подавляя рост патогенных бактерий, что снижает риск инфекций. Пробиотики усиливают иммунную систему сельскохозяйственных птиц, повышая их устойчивость к заболеваниям и стрессам. Кроме того, пробионты улучшают пищеварение и усвоение питательных веществ, способствуя ферментации неперевариваемых компонентов корма и синтезу витаминов группы B и K. Это приводит к ускоренному росту и улучшению откорма, а также к оптимизации конверсии корма, что выгодно с экономической точки зрения.
Использование пробиотиков на основе симбиотической микрофлоры снижает необходимость применения антибиотиков, что уменьшает риск развития устойчивых к антибиотикам бактерий и способствует экологической безопасности, снижая загрязнение окружающей среды патогенами. Пробиотики доступны в различных формах, что облегчает их добавление в корм или воду.
Научные исследования продолжают развивать новые штаммы и комбинации пробиотиков, делая их неотъемлемой частью устойчивого и эффективного птицеводства.
Цель работы — изучение показателя безопасности и пробиотических свойств полезных штаммов рода Lactobacillus, выделенных из кишечного тракта индеек.
Материалы и методы исследования
Эксперименты осуществлялись в январе — марте 2024 г. на кафедре ветеринарной медицины ФГБОУ ВО РГАУ— МСХА им. К.А. Тимирязева, а также на базе Центра биотехнологии при ФГБОУ ВО «Кубанский ГАУ».
Объектом исследований являлись штаммы-пробионты (Ligilactobacillus agilis, Lacticaseibacillus paracasei и Ligilactobacillus salivarius), выделенные из слепых отростков кишечника индеек, а микробиологическими и масс-спектрометрическими методами — идентифицированные до вида.
Изучение безопасности выделенных лактобактерий осуществляли путем исследования продукции ими гемолизина на плотных питательных средах (кровяном агаре) (ООО «Биовитрум», Россия) и внутрибрюшинным введением лабораторным животным (линейным лабораторным мышам BALB/C, крысам линейным Wistar) (ООО «СМК СТЕЗАР», Россия) инактивированных штаммов-пробионтов согласно требованиям.
Для изучения токсичности штаммов-пробионтов in vivo проводили тестирование путем внутрибрюшинного введения взвеси испытуемого штамма, термически обработанной при 100 °С в течение 30 минут, с максимальной концентрацией микробных клеток.
Одним из тестов, используемых для оценки безвредности испытуемых штаммов-пробионтов, является тест на продукцию ими гемолизина (in vitro). Некоторые бактерии продуцируют гемолизины (вещества, разрушающие эритроциты), относящиеся к факторам патогенности. В связи с этим продукция гемолизина во многих случаях является маркером вирулентности.
На кровяном агаре выросшие колонии окружают зоны просветления. Образование гемолизинов (и, соответственно, размеры зон гемолиза) может быть вариабельным, и для адекватного определения гемолитической активности следует просматривать чашки с посевами против источника света.
Активность гемолизинов может проявляться в полном или неполном разрушении эритроцитов.
Исследования с лабораторными животными проводились с соблюдением биоэтических принципов.
Антагонистические свойства исследуемых объектов определяли путем наличия (отсутствия) ингибирующей активности у исследуемых штаммов к патогенным тест-микроорганизмам.
Штаммы микроорганизмов из коллекции Кубанского ГАУ, которые были взяты как условно-патогенные, — Escherichia coli IV, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aerugenosa, Staphylococcus haemoliticus, Escherichia coli II, Enterococcus avium, Salmonella spp. (в табл. 1 данные штаммы условно-патогенных микроорганизмов представлены под номерами 1‒8 соответственно).
Исследуемые полезные культуры микроорганизмов были нанесены на плотную агаризированную питательную бифидум-среду (ФБУН «ГНЦ ПМБ», Россия), культивировались при температуре 36±1 °С, содержание углекислоты в атмосфере — 5%, 24 ч. (компактный CO2 инкубатор S-Bt Smart Biotherm, Biosan, Латвия), затем перпендикулярно росту полезных микроорганизмов были нанесены суточные штаммы условно-патогенных микроорганизмов оптической плотностью бактериальной суспензии, денситометрически соответствующей 0,5 по МакФаранду (денситометр DEN-1, Biosan, Латвия), с последующей инкубацией при температуре 36±1 °С в аэробных условиях (оборудование — компактный CO2 инкубатор S-Bt Smart Biotherm, Biosan, Латвия).
Учет ингибирующей активности осуществляли через 24 часа. Измерение зоны ингибирующей активности осуществляли линейкой-шаблоном для оценки размеров зон задержки роста микроорганизмов PW297 (HiMedia, Индия).
Для изучения пробиотических свойств полезных штаммов микроорганизмов проводили анализ на проявление ими адгезивной и антиадгезивной активности согласно рекомендациям. Для этого использовали суточные культуры штаммов-пробионтов. Объектами для исследования адгезии и антиадгезии служили эритроциты крови барана и энтероциты кишечника эмбрионов крыс, полученные самостоятельно согласно рекомендациям.
Учет реакции адгезивности проводили по среднему показателю адгезии (СПА) согласно рекомендациям5. При СПА от 0 до 1,0 ед. микроорганизм считали неадгезивным, от 1,01 до 2,00 ед. — низкоадгезивным, от 2,01 до 4,00 ед. — среднеадгезивным, от 4,01 ед. и более — высокоадгезивным.
Для расчета антиадгезивных свойств в препаратах подсчитывают число тест-культур патогенного штамма (Staphylococcus aureus), прикрепившихся к 50 эритроцитам (энтероцитам) в одном поле зрения микроскопа («Биомед 6» в комплекте с цифровым дисплеем, ООО «Биомед сервис», Россия). Параллельно подсчитывают количество микроорганизмов тест-штамма, прикрепившихся к клеточным культурам в параллельной пробе, в которую добавляли лактобактерии. Сравнивают полученные данные и проводят учет результатов в процентах. Если количество клеток патогенного тест-штамма, прикрепившихся к 50 эритроцитам (энтероцитам) в смешанной с культурами лактобацилл, меньше, чем в чистой пробе, считается, что культуры лактобацилл обладают антиадгезивными свойствами.
Результаты и обсуждение
При изучении безопасности штаммов-пробионтов путем анализа ими продукции гемолизина in vitro на кровяном агаре установлено, что зоны гемолиза (просветления) вокруг колоний обнаружены не были, что позволило классифицировать гемолитические свойства объекта исследований как отрицательные.
Результаты оценки токсичности исследуемых лактобацилл сведены в таблицу 1.
В ходе исследования токсичности штаммов во всех опытных группах была зафиксирована полная выживаемость подопытных животных. У мышей и крыс отсутствовали признаки токсикоза, нарушения здоровья и потери массы тела к завершению эксперимента. Эти результаты свидетельствуют о том, что штаммы Ligilactobacillus salivarius, Ligilactobacillus agilis иLacticaseibacillus paracase являются нетоксичными и, следовательно, безопасными в максимально используемой концентрации (в пределах ×109 КОЕ/мл).
Ценным показателем пробиотических свойств представителей рода Lactobacillus является способность их продуцировать биологически активные компоненты, обладающие бактерицидным действием в отношении условно-патогенной и патогенной микрофлоры. Данные свойства штаммов-пробионтов были охарактеризованы при проведении экспериментов in vitro на антагонизм путем посева культур микроорганизмов на плотную питательную среду. Результаты антагонистического воздействия изучаемых штаммов лактобацилл на тест-культуры условно-патогенных микроорганизмов представлены в таблице 2 и отображены на рисунках 1, 2.
Установлено, что Ligilactobacillus salivarius, Ligilactobacillus agilis и Lacticaseibacillus paracasei продуцируют метаболиты в питательной среде, обладающие антибактериальным действием, но степень влияния у штаммов-пробионтов различна. Так, выявлены следующие зоны задержки роста тест-культур условно-патогенной микрофлоры по влиянию на них Ligilactobacillus salivarius, Ligilactobacillus agilis и Lacticaseibacillus paracasei: подавление роста Escherichia coli IV на 9,5, 12,0 и 11,0 мм, Staphylococcus aureus — на 7,5, 10,0 и 9,5 мм, Staphylococcus epidermidis — на 4,0, 9,5 и 7,5 мм, Pseudomonas aerugenosa — 5,5, 10,0 и 11,0 мм, Staphylococcus haemoliticus — на 6,5, 9,5 и 9,0 мм, Escherichia coli II — на 9,5, 11,5 и 12,5 мм, Enterococcus avium — на 12,5, 14,0 и 13,0 мм, Salmonella spp. — на 7,5, 12,0 и 12,0 мм соответственно.
Оценка адгезивности по отношению к эритроцитам крови барана показала следующие результаты:
• Ligilactobacillus salivarius — 1,52 ед., что соответствует значению от 1,01 до 2,00 ед. (штамм проявляет низкоадгезивное свойство);
• Ligilactobacillus agilis — 4,35 ед. (более 4,01 ед.), соответственно, штамм высокоадгезивный;
• Lacticaseibacillus paracasei — 4,42 ед., штамм-пробионт с высокоадгезивными свойствами.
Были проведены исследования адгезивности по отношению к энтероцитам кишечника эмбриона крыс. Полученные в результате исследования данные показали, что высокоадгезивные свойства продемонстрировали Ligilactobacillus agilis и Lacticaseibacillus paracasei, так как значение их СПА составило 4,40 и 4,10 ед., при этом показатель СПА Ligilactobacillus salivarius оказался самым низким — 1,70 ед., что соответствует уровню проявления низкоадгезивной активности.
Результаты показателя адгезии Staphylococcus aureus, прикрепившегося к эритроцитам, в исследованиях по изучению антиадгезивности лактобактерий следующие:
• Staphylococcus aureus — показательадгезии0,64 ед. (контроль, без штамма-пробионта);
• Ligilactobacillus salivarius — показательадгезииStaphylococcus aureus составил 0,64 ед., соответственно, штамм-пробионт не проявил антиадгезивных свойств;
• Ligilactobacillus agilis — адгезия тест-культуры к эритроцитам составила0,46 ед., штамм-пробионт проявляет антиадгезивное действие;
• Lacticaseibacillus paracasei — показательадгезииStaphylococcus aureus составил 0,32 ед., штамм с антиадгезивными свойствами.
Полученные данные показывают, что антиадгезивные свойства по отношению к Staphylococcus aureus проявили штаммы-пробионты Ligilactobacillus agilis и Lacticaseibacillus paracasei, при этом значение показателя адгезии тест-штамма патогенной культуры на эритроцитах было ниже контроля на 28,1% и 50,0 % соответственно. Штамм Ligilactobacillus salivarius показал аналогичный показатель адгезии тест-культуры по отношению к контролю, что говорит о его низких антиадгезивных свойствах.
Результаты изучения антиадгезивности исследуемых штаммов-пробионтов по отношению к Staphylococcus aureus, прикрепившимся к энтероцитам, показали следующее:
• Staphylococcus aureus (контроль) — степень адгезии тест-культуры без штаммов-пробионтов составила 5,58 ед.;
• Ligilactobacillus salivarius — степень адгезии условно-патогенного микроорганизма была на уровне контроля и составила 5,58 ед., соответственно, штамм-пробионт не проявляет антиадгезивного действия;
• Ligilactobacillus agilis — адгезия Staphylococcus aureus составила 4,84 ед., штамм проявляет антиадгезивные свойства;
• Lacticaseibacillus paracasei — показал адгезию тест-культуры на уровне 5,08 ед., что говорит о проявлении полезным штаммом антиадгезивных свойств.
Результаты исследования свидетельствуют о том, что штаммы Ligilactobacillus agilis и Lacticaseibacillus paracasei являются наиболее перспективными для дальнейшего изучения, так как продемонстрировали антиадгезивную активность по отношению к тест-культуре условно-патогенного микроорганизма (Staphylococcus aureus), прикрепившегося к энтероцитам кишечника эмбриона крыс, на уровне 13,3% и 9,0 %, при этом Ligilactobacillus salivarius не проявил желаемых свойств и уровень адгезии тест-микрофлоры остался в пределах контроля.
Выводы
Исследования показали, что полезные штаммы-пробионты (Ligilactobacillus agilis, Lacticaseibacillus paracasei и Ligilactobacillus salivarius), выделенные из желудочно-кишечного тракта индеек, являются безопасными, поскольку по результатам проведенных авторами исследований не продуцируют токсин гемолизин и не оказывают токсического воздействия на лабораторных животных. Данные лактобактерии в разной степени проявляют антагонистические свойства, а в условиях in vitro адгезивное свойство по отношению к клеточным моделям, и у них также выявлено антиадгезивное действие по отношению к Staphylococcus aureus, что говорит о формировании метаболитов, препятствующих адгезии условно-патогенных и патогенных тест-культур.
По совокупности проведенных авторами исследований были отобраны два штамма-пробионта лактобактерий — Ligilactobacillus agilis иLacticaseibacillus paracase, которые проявили максимальные пробиотические свойства и в дальнейшем войдут в состав разрабатываемого авторами биопрепарата микробного происхождения.
Об авторах
Юрий Андреевич Лысенко 1, доктор биологических наук, доцент, профессор кафедры ветеринарной медицины
yuraduban45@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-2629-2334
Альбина Владимировна Лунева 1, доктор биологических наук, доцент, профессор кафедры ветеринарной медицины
albina.luneva@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-4863-3590
Анастасия Алексеевна Ковтун 2, аспирант кафедры паразитологии, ветсанэкспертизы и зоогигиены
nastasyakovtun86@yandex.ru
Евгений Юрьевич Марченко 1, кандидат ветеринарных наук, старший преподаватель кафедры ветеринарной медицины
marchenko.vet@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-4863-3590
Маргарита Геннадиевна Яковец 2, аспирант кафедры биотехнологии, биохимии и биофизики
margoyakovets@mail.ru
Евгения Сергеевна Седлецкая 1, кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры ветеринарной медицины
esedletskaya@rgau-msha.ru
1 Российский государственный аграрный университет — МСХА им. К.А. Тимирязева, ул. Тимирязевская, 49, Москва, 127434, Россия
2 Кубанский государственный аграрный университет им. И. Т. Трубилина, ул. им. Калинина, 13, Краснодар, 350044, Россия
УДК 619:579.62:636.592.087.7
DOI: 10.32634/0869-8155-2025-392-03-27-35
