Главная страница » Идентификация вариантов вируса вирусной диареи крупного рогатого скота — контаминантов производственных клеточных линий

Рубрики

21.03.2025

Идентификация вариантов вируса вирусной диареи крупного рогатого скота — контаминантов производственных клеточных линий

Вирус вирусной диареи крупного рогатого скота (ВД КРС), являясь возбудителем множества симптомокомплексов у КРС, включая диарею, геморрагический синдром, репродуктивные и респираторные расстройства, персистирующие инфекции и заболевания слизистых оболочек, приводит к значительным экономическим потерям для мировой животноводческой отрасли. Этот одноцепочечный РНК-содержащий вирус, содержащий одну открытую рамку считывания (ORF), фланкированную 5`- и 3`-нетранслируемыми областями, в настоящее время классифицируется на 3 генотипа: BVDV-1 (Pestivirus A), BVDV-2 (Pestivirus B) и BVDV-3 (Pestivirus H, или HoBi-подобный вирус).

BVDV-1 в настоящее время содержит не менее 22 подтипов (1a–1v), а BVDV-2 — не менее 4 подтипов (2a–2d). Обнаруживаемые изоляты вируса ВД КРС демонстрируют высокую генетическую изменчивость, в первую очередь из-за рекомбинации РНК, затрудняющей диагностику ВД и снижающей эффективность вакцинопрофилактики.

Контаминация вирусом ВД КРС остается постоянной угрозой качеству биологических продуктов. Наиболее распространенным фактором контаминации являются эмбриональные бычьи сыворотки — основной фактор поддержки роста при культивировании клеточных линий, применение которых делает риск распространения вируса ВД КРС практически неизбежным.

Длительное культивирование производственных клеточных линий (ПКЛ) с использованием вируссодержащих сывороток без их надлежащего тестирования на контаминацию приводит к производственным потерям и некорректной интерпретации данных в исследованиях механизмов взаимодействия вируса с клеткой. В свою очередь, загрязнение вакцин живым вирусом может привести к иммуносупрессии у поголовья и последующему развитию оппортунистических инфекций.

Таким образом, постоянный скрининг эмбриональных сывороток и ПКЛ на предмет контаминации вирусом ВД КРС имеет решающее значение для обеспечения безопасности вакцин, используемых в популяциях КРС. Определенную сложность при этом представляют нецитопатогенные (НЦП) варианты вируса, репродуцирующиеся в клетках без морфологических изменений.

Цель исследования — идентификация вариантов вируса ВД КРС — контаминантов ПКЛ, применяемых в Федеральном центре токсикологической, радиационной и биологической безопасности «ФЦТРБ-ВНИВИ».

Материалы и методы исследования

Исследования проведены с мая по июнь 2024 г. на базе лаборатории вирусных антропозоонозов и лаборатории молекулярно-генетического анализа ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ».

Характеристики образцов исследуемого материала представлены в таблице 1.

ОТ-ПЦР и определение нуклеотидных последовательностей изолятов

Суммарную РНК выделяли из клеточных суспензий в объеме 0,1 см³с помощью набора реагентов «РИБО-сорб» (ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Россия) согласно инструкции производителя. Для амплификации целевых участков вирусного генома применяли олигонуклеотидные праймеры, фланкирующие фрагмент высококонсервативной нетранслируемой области 5`UTR длиной 289 п. н. (Fp BVDV-UTR 5`-ATGCCCATAGTAGGACTAGC-3`, Rp BVDV-UTR 5`-CTCCATGTGCCATGTACAG-3`).

Состав реакционной смеси для ОТ-ПЦР из расчета на одну пробу объемом 20 мкл был следующим: 2 мкл 10х Taq-Turbo буфера (2,5 мМ Mg²⁺), 3 мМ смеси dNTP, 1,0 единица Taq ДНК-полимеразы, 5 мкМ прямого и обратного праймеров, 0,2 мкл MMLV-ревертазы (ЗАО «Евроген», Россия), 15 нг ДНК-матрицы, ddH₂O — до 20 мкл.

ОТ-ПЦР проводили на амплификаторе С1000 с оптическим блоком CFX96 (Bio-Rad, США) согласно следующей программе: 1 — обратная транскрипция при 37 ºС в течение 60 мин.; 2 — денатурация ДНК при 95 ºС в течение 5 мин.; 3 — 35 циклов, состоящих из: 30 с при 94 ºС, 30 с при 54 ºС, 25 с при 72 ºС; 4 — элонгация при 72 ºС в течение 10 мин. Наличие целевых продуктов амплификации контролировали методом электрофореза в 1,7%-ном агарозном геле в присутствии бромистого этидия с последующей визуализацией в УФ-свете.

Ферментативно очищенные продукты ПЦР с расчетной длиной 289 п. н. секвенировали по Сэнгеру на аутсорсе (ЗАО «Евроген», Россия) на автоматическом секвенаторе 3500xL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) с использованием праймеров для амплификации. Гомологичные нуклеотидные последовательности области 5`UTR определяли методом множественного выравнивания с последовательностями штаммов и изолятов вируса ВД КРС 1 и 2 генотипов, депонированными в базе данных Национального центра биотехнологической информации (Genbank, NCBI, США), применяя программное обеспечение MEGA 11.0 (Mega Software, США).

Эволюционные дистанции между последовательностями рассчитывали методом максимального правдоподобия согласно двухпараметрической модели Kimura. Топологию филограмм оценивали на основании анализа 1000 псевдореплик; различия между кластерами считали достоверными, если индекс поддержки в узлах составлял не менее 70.

Результаты и обсуждение

Известно, что процесс выделения вируса ВД КРС на культурах клеток является длительным, трудоемким и неэкономичным, требуя определенных условий отбора, хранения и транспортировки проб; зачастую он осложняется контаминацией большинства линий, применяемых в диагностических лабораториях, НЦП вариантами вируса.

Несмотря на то что вирусовыделение является «золотым стандартом» диагностики ВД КРС в различных клинических проявлениях, более распространенным стало использование молекулярно-генетических методов, не требующих наличия инфекционного вируса для получения положительного результата. В настоящем исследовании геном возбудителя ВД КРС был обнаружен в большинстве клеточных образцов (табл. 2), что подтверждалось электрофоретически наличием соответствующих ПЦР-продуктов (рис. 1), при этом присутствие контаминантов в ПКЛ не сопровождалось видимыми морфологическими изменениями клеточного монослоя. Это подтверждает факт хронической инфекции данных ПКЛ вирусом ВД КРС нецитопатогенного типа.

Обнаруженные контаминанты были условно обозначены как MDBK/1, MDBK/2, ВНК-21/1, PK-15/1. Не менее важным этапом скрининга ПКЛ является сравнительный анализ молекулярно-генетической структуры сторонних вариантов вируса, позволяющий отследить их распространение и усовершенствовать методы индикации.

Проведенный филогенетический анализ позволил установить принадлежность всех вариантов вируса к субгенотипу 1а (рис. 2).

Таким образом, было установлено значительное сходство выявленных контаминантов между собой (96,8–99,2% идентичности). В качестве ближайших гомологов были идентифицированы штаммы CH888 (ID AY671977) и LL795 (ID GU987133.1), выделенные от лам и альпак предковой популяции в чилийском Альтиплано в 2013 г., а также изолят Deer (AB040132.1), выделенный от серонегативной косули в Германии в 1991 г.

Особую проблему представляет контаминация вирусом ВД КРС клеток свиного происхождения, используемых для производства биологических продуктов и проведения диагностических тестов в отношении вируса классической чумы свиней (КЧС) — другого экономически значимого представителя рода Pestivirus.

Гомология данных возбудителей и их тесная серологическая связь зачастую приводят к перекрестным реакциям сывороток и моноклональных антител. Учитывая способность вируса ВД КРС инфицировать свиней, а также его серопревалентность в популяциях свиней, невакцинированных от КЧС, это может приводить к диагностическим ошибкам. Так, во время вспышки КЧС в Нидерландах в 1997 г. дифференциация антител была значительно затруднена из-за получения ложноположительных результатов в ИФА.

Современные данные свидетельствуют о том, что в процессах интернализации вирусов КЧС и ВД КРС задействован общий рецептор — бычий кластер дифференцировки CD46, демонстрирующий порядка 55% идентичности. В связи с этим идентификация актуальных контаминирующих вариантов вируса ВД КРС может быть информативной для внесения изменений в структуру рекомбинантных диагностических антигенов вируса КЧС, что позволит достоверно дифференцировать антитела, специфичные для разных представителей рода Pestivirus.

Выводы

В ходе скрининга основных производственных клеточных линий (преимущественно бычьего и свиного происхождения) был выявлен факт контаминации некоторых из них нецитопатогенным вирусом ВД КРС.

При секвенировании 5`-нетранслируемой области генома все обнаруженные варианты вируса были идентифицированы как представители субгенотипа 1a. Представленные данные демонстрируют необходимость постоянного проведения подобных скринингов клеточных линий и реактивов, используемых при их культивировании, что позволит обеспечить контроль качества технологического сырья при производстве биологических продуктов, а также усовершенствовать существующие средства серологической диагностики инфекций, вызываемых другими представителями рода Pestivirus.

Об авторах

Антонина Глебовна Галеева^{1, 2}; кандидат ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник

antonina-95@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0003-2650-6459

Алсу Рузалевна Ахунова¹; младший научный сотрудник

aahunova@inbox.ru; https://orcid.org/0009-0006-0211-3334

Наиль Ильдарович Хаммадов¹; кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник

nikhammadov@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-5669-1486

Диана Анатольевна Сорокина¹; младший научный сотрудник

diana-sorokina2013@mail.ru; https://orcid.org/0009-0006-5339-5175

Айнур Ильнурович Яруллин¹; кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник

abii@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-1717-0498

Алсу Магъфуровна Хафизова¹; младший научный сотрудник