Идентификация полиморфных SNP в генах IGF2BP2 и BMPR1B у оренбургской и карачаевской пород коз
С момента одомашнивания козы распространились по всему миру благодаря своим биологическим особенностям. Высокая адаптивность к различным климатическим условиям позволяет козам выживать в высокогорных и полупустынных районах со скудной растительностью и при этом производить уникальную продукцию, такую как козий пух, могер, козье молоко и козлятина. В современном мире наблюдается глобальная тенденция на увеличение спроса на козоводческую продукцию, в связи с чем происходит рост их численности.
Высокую экономическую ценность в козоводстве имеют репродуктивные способности коз. Целесообразно проводить повышение плодовитости самок путем увеличения размера приплода для создания предпосылок повышения селекции. Однако размер приплода является признаком с низкой наследуемостью у коз, поэтому традиционный прямой отбор неэффективен.
Для улучшения признаков с низкой наследуемостью на помощь приходит маркер-ориентированная селекция (marker-assisted selection, MAS), основанная на соответствующих генетических вариантах. Чтобы упростить применение MAS для увеличения размера приплода в козоводстве, необходимо обнаружить и проверить важные генетические варианты, обеспечивающие фенотипическое преимущество.
Для поиска новых генетических вариантов в настоящее время используются полногеномное секвенирование и полногеномные исследования ассоциаций (genome-wide association study, GWAS). В предыдущих работах сообщалось о влиянии генов IGF2BP2 и BMPR1B на репродуктивные способности коз.
Полногеномный анализ ассоциаций, проведенный в 2019 году, выявил белок 2, связывающий мРНК инсулиноподобного фактора роста 2 (IGF2BP2) в качестве гена-кандидата, связанного с плодовитостью коз. Этот ген кодирует белок, который связывается с 5′-нетранслируемой (5`UTR) областью мРНК инсулиноподобного фактора роста 2 (IGF2) и регулирует ее трансляцию.
В недавнем исследовании была подтверждена важнейшая роль гена IGF2BP2 в регулировании функции эндометрия путем модуляции пролиферации и миграции эмбриональных стволовых клеток овец. К тому же в другой работе было показано, что белок, образующийся в результате экспрессии гена IGF2BP2, играет важную роль в регулировании восприимчивости эндометрия к эмбриону у молочных коз породы Guanzhong.
Позднее Xin D. и соавт. обнаружили вставку (делецию) размером 13 п. о. в гене IGF2BP2, которая оказывала достоверное влияниена многоплодие коз породы Shaanbei White Cashmere. В результате проведенной работы авторами был выявлен предпочтительный гомозиготный генотип DD — делеция.
В качестве гена-кандидата, влияющего на размер помета, был предложен ген BMPR1B, которыйявляется членом семейства рецепторов костного морфогенетического белка и играет важную роль в регулировании роста фолликулов, развития эмбрионов и размера помета. Впервые взаимосвязь полиморфизма гена BMPR1B со скоростью овуляции и размером приплода была выявлена у овец.
Однако проведенные ранее исследования коз не выявили наличия в популяциях мутации FecB (Booroola) у ассамского горного козла иранской породы Мархоз и тибетской кашемировой козы. Другие исследования не обнаружили достоверных ассоциаций мутации FecB с размером помета у иранской и семи индийских пород, лишь в одной индийской породе черных бенгальских коз было выявлено существенное влияние мутации FecB на размер гнезда.
При этом в исследованиях у коз были обнаружены новые SNPs: уникальная для ассамских горных козлов мутация (c. 773G > C), два SNP в 8-м экзоне у коз породы Мархоз (с.775A > G и с. 777G > A).
В 2024 году Ullah I. и соавт. обнаружили 3 новых SNP в промоторной области гена BMPR1B, среди которых один (g. 67A > C) был достоверно связан с размером помета у коз породы Дамани.
На сегодняшний день роль генов IGF2BP2 иBMPR1B в формировании многоплодия у коз малоизучены. В связи с этим актуально проводить исследования полиморфизма вышеназванных генов у коз малоплодных и многоплодных пород.
Среди разнообразия отечественных пород коз оренбургская пуховая порода является одной из наиболее многоплодных. Плодовитость в среднем составляет 140 козлят на 100 маток. У 52,6% маток рождаются двойни, встречаются случаи (около 2%) рождения троен. Известно, что карачаевские козы относятся к относительно малоплодным животным. По данным литературных источников, плодовитость карачаевских коз находится в пределах 1,19‒1,26.
Цель данной работы — изучение полиморфизма генов-кандидатов репродуктивных качеств (IGF2BP2 иBMPR1B) у оренбургской пуховой породы коз в сравнении с карачаевской.
Материалы и методы исследования
Исследование проводили в 2024 году. Животных, использованных в исследовании, содержали в соответствии с этическими рекомендациями, утвержденными Комиссией по этике экспериментов на животных ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста (протокол от 24 февраля 2025 года № 2).
В качестве биологического материала для молекулярно-генетического исследования использовали биопробы ткани с ушной раковины площадью 1 см2 (ушные выщипы) у козочек карачаевской (n = 15) и оренбургской пуховой (n = 15) пород возрастом от 1,5 до 2,2 года.
Образцы ткани коз карачаевской породы были отобраны в племенном заводе «Ладожский» (Усть-Лабинский р-н, Краснодарский край, Россия) в ходе экспедиции сотрудников ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста в 2024 году. Образцы отбирали в соответствии с действующими правилами проведения лабораторных исследований (испытаний) при осуществлении ветеринарного контроля (надзора), утвержденными Решением Совета Евразийской экономической комиссии от 10 ноября 2017 года №80. Транспортировку образцов осуществляли в пробирках типа эппендорф в 96%-ном спиртовом растворе (рис. 1).
Образцы ткани коз оренбургской пуховой породы (рис. 2) были получены из биоресурсной коллекции «Банк генетического материала домашних и диких видов животных и птицы» ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста, входящей в состав биологических коллекций национального Центра генетических ресурсов сельскохозяйственных животных, образованного на базе ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста. Биопробы коз оренбургской пуховой породы были отобраны в Государственном козоводческом племенном хозяйстве «Губерлинский» в 2017 году.
ДНК из ткани выделяли с использованием набора «ДНК-Экстран-2» (ЗАО «Синтол», Россия) по протоколу производителя. Целостность полученных растворов геномной ДНК определяли в 1%-ом агарозном геле.
Качество и количество определяли с использованием спектрофотометра NanoDropTM 8000 (ThermoFisher Scientific, Inc., США) и Quibit 4.0 (Invitrogen/Life Technologies, США). К дальнейшему исследованию были отобраны пробы высокого качества (соотношение OD260/280 > 1,8) и с концентрацией 30 нг/мкл при объеме не менее 100 мкл.
Полногеномное секвенирование проведено по технологии NGS (next generation sequencing) на секвенаторе NovaSeq 6000 (Illumina, Inc., США). Подготовка библиотек для секвенирования была выполнена с использованием наборов TruSeq DNA Nano Library Prep kit (Illumina, Inc., США) и Accel-NGS® 2S Plus DNA Library Kit (IDT) for Illumina® Platforms (Swift Biosciences, Inc., США).
Выравнивание на референсный геном Capra_hircus.ARS1.dna_sm.toplevel.fa.gz (https://ftp.ensembl.org/pub/release-113/fasta/capra_hircus/dna/) проводили с помощью инструментов bwa-mem2 [22] и SAMtools [23]. Из полных геномов были извлечены полные последовательности генов-кандидатов, влияющих на репродуктивные способности коз (IGF2BP2 и BMPR1B), в которых был осуществлен поиск однонуклеотидных полиморфизмов. Гены были найдены согласно их координатам в референсном геноме Capra_hircus.ARS1.dna_sm.toplevel.fa.gz.
Координаты включали номер хромосомы, нуклеотидную позицию начала гена, нуклеотидную позицию конца гена, указание цепи ДНК (1 — прямая, -1 — обратная). Были использованы следующие координаты для исследуемых генов: 1:81080594-81243253:1 для гена IGF2BP2 (запись в Ensembl ENSCHIG00000015258); 6:29894143-30259719:-1 для гена BMPR1B (запись в Ensembl ENSCHIG00000017761).
Непосредственное извлечение полных последовательностей изучаемых генов проводили с использованием инструментов bwa-mem2 и SAMtools по авторским скриптам.
Наиболее различающиеся SNPs в анализируемых генах выбирали на основании расчета значений FST для каждого SNP внутри каждого гена, выполненного с использованием программного обеспечения PLINK 2.
Результаты и обсуждение
При сравнении нуклеотидной последовательности генов IGF2BP2 и BMPR1B у коз карачаевской и оренбургской пуховой пород были выявлены наиболее различающиеся SNPs на основании расчета значений FST. Наибольшие различия в последовательностях были выявлены в гене BMPR1B: 11 SNPs со значениями FST от 0,513305 до 0,596852. в то время как в гене IGF2BP2 было выявлено всего 2 SNPs (FST = 0,453078).
В таблице 1 представлены наиболее различающиеся SNPs у коз карачаевской и оренбургской пуховой пород по исследованным генам.
Все обнаруженные SNPs находили в интронных последовательностях генов. В гене IGF2BP2 были обнаружены два SNPs в 13-м интроне; в гене BMPR1B один SNP находился в 1-м интроне и 10 SNPs — во 2-м.
В предыдущих исследованиях у разных видов сельскохозяйственных животных была выявлена взаимосвязь некодирующих областей генома с экспрессией генов посредством изменения связывания факторов транскрипции (TFs). К примеру, однонуклеотидный полиморфизм (c. 2366G > A) в 3`UTR области костного морфогенетического белка 15 (BMP15) существенно влияет на репродуктивные признаки крупных белых свиней. К тому же делеция во 2-м интроне размером 13 п. о., обнаруженная в 2021 году в гене IGF2BP2,оказывала достоверное влияние на размер помета у коз.
В связи с этим возможно предположить, что выявленные SNPs в данном исследовании влияют на репродуктивные способности у коз. Затем были выявлены генотипы в найденных позициях в исследуемых генах.
В таблице 2 представлены частоты генотипов и аллелей, встречаемых в наиболее различающихся SNPs у оренбургских пуховых и карачаевских коз в гене IGF2BP2.
Примечательно, что у карачаевской породы коз по обоим SNPs преобладал один аллельный вариант с частотой встречаемости 0,967 (G и A). Второй аллель присутствовал в популяции лишь в гетерозиготном состоянии у одного животного. Коз с гомозиготным генотипом по второму аллелю у карачаевской породы не встречали.
В таблице 3 представлены частоты генотипов и аллелей, встречаемых в наиболее различающихся SNPs у оренбургских пуховых и карачаевских коз в гене BMPR1B.
В гене BMPR1B были обнаружены 11 наиболее различаемых SNPs между оренбургской пуховой и карачаевской породами коз, из которых 3 SNPs были обнаружены впервые (позиции: 6:30181500; 6:30182340; 6:30183259). Один SNP (rs635883131) у коз оренбургской пуховой породы представлен лишь одним аллельным вариантом (А), в то время как у карачаевских коз встречались все три генотипа (АА, AG, GG).
Что касается остальных SNPs, оренбургские пуховые козы характеризовались меньшим полиморфизмом в сравнении с карачаевскими. Во всех SNPs у представителей оренбургской пуховой породы отсутствовал второй гомозиготный генотип, в то время как у карачаевских коз он был преобладающим.
Плодовитость коз является важнейшим признаком, влияющим на рентабельность козоводства, в связи с этим большой интерес у ученых вызывает идентификация генов, влияющих на размер приплода коз. В настоящей работе были исследованы два перспективных гена-кандидата IGF2BP2 иBMPR1B, которые влияют на репродуктивные способности коз. Впервые был изучен полиморфизм полных последовательностей генов IGF2BP2 иBMPR1B у коз, что позволило обнаружить новые SNPs, наиболее различающиеся у многоплодных и малоплодных пород коз.
Предыдущие исследования гена IGF2BP2 позволили обнаружить делецию во 2-м интроне, оказывающую достоверное влияние на многоплодие коз породы Shaanbei White Cashmere.
В дополнение к известной мутации авторами были обнаружены два SNPs, наиболее различающиеся у многоплодной и малоплодной пород коз.
Больший интерес исследователей вызвал ген BMPR1B. Однако не было выявлено достоверных ассоциаций известной мутации FecB с размером приплода у большинства исследованных пород коз, при этом были обнаружены новые SNPs.
Найденные 11 SNPs в данном исследовании не были изучены ранее у коз.
Выводы
Таким образом, авторами был изучен полиморфизм в генах-кандидатах репродуктивной функции (IGF2BP2 иBMPR1B) у более многоплодной оренбургской пуховой породы коз в сравнении с менее многоплодной карачаевской породой коз.
В ходе проведенной работы были выявлены SNPs, которые наиболее различались у оренбургской пуховой и карачаевской пород коз. Поскольку ген IGF2BP2 — это основной кандидат, связанный с увеличением рождаемого потомства у коз, были определены всего 2 различающихся SNP в этом гене.
В обоих SNP у коз оренбургской пуховой породы было отмечено преобладание гетерозиготных генотипов над гомозиготными, но, основываясь на этом, авторы не могут пока еще рекомендовать эти SNP как целевые для внедрения в маркерную селекцию. Безусловно, необходимо продолжать изучение гена IGF2BP2 в аспекте анализа иных типов полиморфизма — структурных вариантов (делеции и дупликации).
Таким образом, ген BMPR1B был более перспективным для включения в программы селекционных работ в качестве потенциального генетического маркера многоплодия. Генотип AA в SNP rs635883131 был фиксированным, а частоты встречаемости генотипов AA и GG в SNP rs661196106 и SNP rs637357425, соответственно, преобладали в выборке коз оренбургской пуховой породы. В связи с этим после проведения валидации генотипов в этих SNP путем анализа ассоциации с конкретными показателями многоплодия можно рекомендовать эти SNP как целевые маркеры.
Об авторах
Ольга Андреевна Кошкина, кандидат биологических наук, научный сотрудник
olechka1808@list.ru https://orcid.org/0000-0003-4830-6626
Татьяна Евгеньевна Денискова, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник
horarka@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-5809-1262
Александра Сергеевна Абдельманова, доктор биологических наук, старший научный сотрудник
abdelmanova@vij.ru https://orcid.org/0000-0003-4752-0727
Надежда Александровна Чурбакова, аспирант
nadushik95@mail.ru https://orcid.org/0009-0006-1061-2715
Анастасия Дмитриевна Соловьева, младший научный сотрудник
anastastasiya93@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-2628-9554
Арсен Владимирович Доцев, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник
arsendotsev@vij.ru https://orcid.org/0000-0003-3418-2511
Наталия Анатольевна Зиновьева, доктор биологических наук, профессор, академик Российской академии наук
n_zinovieva@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-4017-6863
Федеральный исследовательский центр животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста,
пос. Дубровицы, 60, г. о. Подольск, Московская обл., 142132, Россия
УДК 636.39
DOI: 10.32634/0869-8155-2025-398-09-62-68
