Идентификация генов, ассоциированных с цветовыми характеристиками мясной и жировой ткани скота абердин-ангусской породы
Визуальные стимулы оказывают значительное влияние на мнение потребителей мясной продукции, поскольку именно от первого восприятия может зависеть покупка или отказ от конкретного продукта. Часто первым впечатлением о продукте является его визуальная ассоциация, и они часто отвергаются или выбираются не по вкусу или запаху, а по внешнему виду, в связи с чем цвет является одним из наиболее важных показателей качества и оказывает непосредственное влияние на восприятие продукта потребителем. Помимо геометрических показателей (форма, изменчивость однородности, масса), цвет является ключевой оптической характеристикой. Ramanathan с соавт. (2022 г.) подсчитали, что примерно 2,55% говядины выбраковывается из-за обесцвечивания, и это приводит к экономическим потерям в 3,73 млрд долларов ежегодно только для мясной промышленности США. Данные цифры иллюстрируют масштабы экономического ущерба во всем мире.
Аналогичным образом розовый цвет копченого мяса является признаком правильно проведенного процесса копчения, а изменение цвета вызывает у потребителей недоверие к качеству и безопасности таких продуктов. С другой стороны, можно ожидать определенных изменений цвета, например свежего мяса, которое при нагревании меняет цвет с красного на коричневый или серый. Такое изменение связано с правильно проведенным процессом приготовления, то есть полное изменение цвета поверхности мясного фарша является показателем того, что частицы мяса были достаточно приготовлены. Для определения цветовых аспектов проводятся их измерения с помощью спектрометра, который определяет различные фракции миоглобина в определенных углублениях светового спектра, или колориметра, который количественно определяет цвет мяса путем среднего расчета точек модели Lab. В настоящее время была разработана и внедрена CVS (система компьютерного зрения) как более точный метод определения цвета. Она имеет преимущества из-за меньшего отклонения света через матрицу мяса и более широкой области обзора образца. Сообщается, что на интенсивность цвета свежего мяса влияет взаимодействие множества внутренних и внешних факторов во время преобразования мышц в мясо.
Внутренние факторы — характеристики, в основном определяемые генотипом животных, которые достаточно трудно изменить. Напротив, внешние факторы — обстоятельства, связанные с обращением человека с животными во время кормления, транспортировки, убоя и охлаждения, которые можно более гибко регулировать в ходе технологического процесса и улучшить до более высокого уровня.
В России результаты по измерению и прогнозированию цветовых характеристик мяса проводились на товарных гибридах свиней, филе осетровых рыб и говядины. Генетическая архитектура цветовой шкалы представлена на курах F2 ресурсной модельной популяции.
Цель исследования — определение генов-кандидатов, взаимосвязанных с цветовыми характеристиками мяса и жира у крупного рогатого скота абердин-ангусской породы, на основании полногеномного анализа ассоциаций.
Материалы и методы исследования
Послеубойные характеристики животных оценивались на базе мясоперерабатывающего завода ООО «Брянская мясная компания» (Брянская обл., Россия) в 2022 году (n = 180) по следующим показателям: вес туши, мраморность, площадь мышечного глазка (рибая), толщина жира над 12-м ребром.
Для измерения цветовых характеристик мяса использовался спектрофотометр CM-700d (Konica Minolta, Япония) по модели CIELAB. При помощи прибора были определены цветовые характеристики в пяти точках «мышечного глазка» (рис. 1).
Ранее проведенные исследования по фактическим данным спектра и его взаимосвязи с мясной продуктивностью бычков представлены в статье А.А. Сермягина с соавт.
В качестве материала для молекулярно-генетических исследований использовали пробу крови, которую брали из яремной вены быка. Для этого брали кровопускательную иглу и стерильную пробирку, куда набирали биоматериал по стенке. Сосуд следует расположить к нижней трети шеи животного. Голова фиксируется, что тоже является стрессом. Чтобы вызвать быстрое наполнение вены, уменьшить ее подвижность, кровеносный сосуд можно сдавить резиновым жгутом в середине шеи. Выделение геномной ДНК проводили с помощью наборов для выделения серии фирмы-производителя (ЗАО «Синтол», Россия) в соответствии с протоколом. Концентрацию двухцепочечной ДНК определяли с помощью флуориметра Qubit 2.0 (Invitrogen/Life Technologies, США). Для определения качества выделяемого продукта измеряли соотношение OD260/OD280 (cпектрофотометр NanoDrop8000, ThermoFisher Scientific, США). Для анализа использовали ДНК с OD260/OD280 = 1,6–1,8, качество оценивали посредством гель-электрофореза в 1%-ном агарозном геле. Полногеномное генотипирование проводили с использованием высокоплотных ДНК-чипов BovineHD Genotyping BeadChip (платформа GeneSeek Genomic Profiler, Neogene, США), содержащих 53 218 SNP.
Тестовый анализ полногеномных ассоциаций осуществляли с помощью программы Plink 1.90 с учетом популяционной стратификации. Контроль качества и фильтрацию данных генотипирования для каждого SNP и каждого образца выполняли с использованием программного пакета PLINK 1.9, применяя следующие фильтры: сall-rate по всем исследуемым SNP для индивидуального образца не ниже 90%; сall-rate для каждого из исследованных SNP по всем генотипированным образцам не ниже 90%; частота встречаемости минорных аллелей (MAF) ≥ 0,05; отклонение генотипов по SNP от распределения по Харди — Вайнбергу в совокупности протестированных образцов.
Для подтверждения достоверного влияния SNP и определения значимых регионов в геноме свиней использовали тест для проверки нулевых гипотез по Бонферрони при пороговом значении p < 1,25 × 10-6, 0,05/39 928. Суггестивный уровень представляет собой порог, при котором при нулевой гипотезе ожидается один ложноположительный результат на одно сканирование генома.
Для поиска генов-кандидатов, локализованных в области идентифицированных SNP, использовали геномный ресурс ARS-UCD2.0.
Функциональные аннотации и выявление обогащения генов выполняли с привлечением базы данных DAVID и Animal QTL.
Экспериментальные процедуры, использованные в настоящем исследовании, не противоречат Европейской конвенции по защите позвоночных животных.
Результаты и обсуждение
В проведенном исследовании был проведен контроль качества однонуклеотидных полиморфизмов в программе PLINK 1.9 (фильтры представлены в разделе «Материал и методы исследования»), после которого количество SNP составило 39 928.
Результаты GWAS-анализа по оттенку мяса от темного к светлому (L*, рис. 2) показали значимые результаты на хромосомах 2–4, 7, 10, 12, 18, 20, 22 и 26, где достоверность (р) варьировалась от 9,85 х 10-4 (Hapmap42518-BTA-34464 SNP) до 5,99 х 10-6 (BTA-109138-no-rs SNP).
По зелено-пурпурному оттенку (а*, рис. 3) мяса установлены 37 SNP на 16 хромосомах из 29, и р варьировалось от 9,01 х 10-4 (BTB-00566241) до 8,45 х 10-5 (Hapmap50771-BTA-74233).
По желто-голубому оттенку (b*, рис. 4) выявлено 66 SNP на 19 хромосомах из 29. Достоверность имеет диапазон от 9,98 х 10-4 (ARS-BFGL-NGS-97889) до 9,35 х 10-5 (BTB-00396331 и BTB-00396414).
По всем признакам цветовых характеристик мяса и жира выявлены 233 SNP, из которых 147 — по мясу, 86 — по жиру. Из данного количества однонуклеотидных полиморфизмов обнаружены 164 гена, где 102 — по мясу, 62 — по жиру, внутри которых находится SNP или сцепленных с ним (±0,2 Мб).
Структурная аннотация SNP (табл. 1) показала наличие 25 генов, ассоциированных с цветовыми характеристиками мяса абердин-ангусской породы крупного рогатого скота. Из них в 2 генах локализованы выявленные SNP — белок 2, родственный рецептору LRP (LRP2), и каннабиноидный рецептор 2 (CNR2) на 2-й хромосоме. Ген LRP2 аннотирован у млекопитающих, в частности у человека. Так, в исследованиях Yuan Zhou и др. он выявлен с помощью полногеномного ассоциативного исследования и ассоциирован с риском рецидива рассеянного склероза. Один из полиморфизмов гена CNR2 влияет на массу тела и резистентность к инсулину у людей, склонных к ожирению и имеющих сахарный диабет. Для подчеркивания важности взаимосвязи данных генов со спектральными значениями мяса обратимся к направлению нутригеномики.
Исследования нутригеномики были проведены на людях и мышах для изучения молекулярной основы таких заболеваний, как ожирение, сердечно-сосудистые заболевания и рак, чтобы понять их через взаимодействие между генами, отвечающих за питание. Обычно модели грызунов используются в научных исследованиях для изучения влияния признаков на функцию генома. Хотя подобные методы на сельскохозяйственных животных всё еще находятся в состоянии развития, исследования в области нутригеномики совершенствуются, особенно в мясной промышленности, поскольку мясные продукты напрямую влияют на здоровье человека. Нутригеномные исследования помогли лучше понять клеточные пути, которые таким образом влияют на профиль жирных кислот и мраморность мяса. Данная информация может принести пользу животноводческой отрасли, стимулируя ее производить вещества или химические соединения, которые могут модулировать экспрессию генов, что приводит к улучшению качества мяса.
Цвет подкожной жировой ткани зависит от возраста, пола и породы крупного рогатого скота. Наиболее важным внешним фактором является состав рациона, и его влияние зависит от продолжительности кормления. У крупного рогатого скота, кормом которого является зеленая масса, обычно жир туши более желтый, чем у животных, которые получают концентраты, что вызвано содержанием каротиноидов в зеленом корме. Хотя во многих странах к желтому тушному жиру относятся негативно, данные свидетельствуют о том, что он связан с более здоровым профилем жирных кислот и содержанием антиоксидантов в говядине.
Проведенный полногеномный анализ по жиру спектра L* (рис. 5) выявил 35 значимых SNP на хромосомах 2–11, 15, 19, 21, 22, 24, 25, 28 и 29. Наибольшее значение достоверности у SNP BTB-01576481, расположенного на 9-й хромосоме (р = 7,47 х 10-5), наименьшее — у BTA-72397-no-rs и BTB-00168676, находящихся на 4-й хромосоме (р = 9.98 х 10-4).
GWA-анализ по оттенку жира а* (рис. 6) обнаружил 28 SNP на 15 хромосомах из 29 идентифицированных. SNP BTA-106005-no-rs на 22-й хромосоме имеет наибольшую достоверность (р = 6,52 х 10-5), а SNP BTB-01786632 и ARS-BFGL-NGS-117317 — наименьшую при р =9,70 х 10-4.
Полногеномный анализ цветового оттенка жира b* (рис. 7) выявил 23 SNP на хромосомах 1, 2, 4, 6, 8–11, 13–16, 25 и 29. Набольшее значение достоверности имеет SNP BTB-01757448 на 8-й хромосоме (р = 8,95 х 10-5), наименьшее — SNP Hapmap48671-BTA-17038, расположенный на 11-й хромосоме (р = 9.98 х 10-4).
Структурная аннотация значимых SNP (табл. 2), ассоциированных с показателем цвета жировой ткани, показала наличие 26 генов, из них внутри 2 находятся однонуклеотидные полиморфизмы ген SCIN, расположенный на 4-й хромосоме, и ген ANTXR1 — на 11-й. В полногеномных ассоциативных исследованиях Slim Ben-Jemaa и др., проведенных на популяции маремманского скота, идентифицированный ген SCIN участвует в нескольких биологических процессах (BP), связанных с актином — важным фактором сократительных свойств мышц, таких как укупоривание нитей (GO:0051693), их разрыв (GO:0051014), полимеризация или деполимеризация (GO:0008154) и реорганизация цитоскелета (GO:0031532). Актин является строительным блоком тонких нитей скелетных мышц и вместе с миозином может влиять на качество мяса после убоя.
Ген ANTXR1 (рецептор 1 сибиреязвенного токсина) участвует во множестве, казалось бы, несвязанных между собой действий, включая реакцию хозяина на инфекцию Bacillus anthracis, регуляцию отложения коллагена в тканях и работу в качестве рецептора сенекавируса А (SVA), также известный как вирус долины Сенека (SVV). Более того, активация гена ANTXR1 в опухолях делает SVA удобным терапевтическим методом для целенаправленного уничтожения раковых клеток. В исследовании Paula R. Chen и др. биологическую значимость гена ANTXR1 как рецептора SVA оценивали путем заражения свиней, у которых была делеция и/или вставка нуклеотидов в первом экзоне. Нокаутные по гену ANTXR1 (KO) свиньи демонстрировали признаки, соответствующие редкому заболеванию человека — синдрому ГАПО (синдром множественных врожденных аномалий соединительной ткани). Фибробласты свиней дикого типа (WT) поддерживали репликацию SVA, тогда как фибробласты свиней КО устойчивы к инфекции.
В совокупности все функционально полученные гены (табл. 3) в программе DAVID можно разделить на следующие группы:
- Функции нервной системы — развитие ЦНС (гены GRHL3, SCIN, ELP3, THOC6), развитие и процесс нервной системы (гены RBFOX2, CHRNA3, CHRNA5, NRG4, SEMA7A, DPF2).
- Развитие органов, сосудов, суставов — развитие аорты (ген LRP2), развитие кровеносных сосудов, развитие зачатков мочеточника (ген BMPER), развитие кровеносных сосудов (ген ANTXR1), развитие почек и сердца (гены BMP10, ADAP2, GREB1L, RBM20), развитие легких, органов животных (гены FGF2, CYP1A2), развитие мышечных органов (ген COPRS), мозга (ген IER3IP1), кровеносных сосудов (ген TCF7L2).
- Метаболические процессы и биосинтез — метаболический процесс жирных кислот, желчных кислот, транспорт желчных кислот, регуляция бета-окисления жирных кислот, гомеостаз холестерина (ген ABCB11), регуляция метаболического процесса (ген CNR2), катаболический процесс лейцина, процесс их обмена, процесс биосинтеза кетоновых тел (ген HMGCL), положительная регуляция бета-окисления жирных кислот (ген TWIST1), гомеостаз глюкозы (ген RMI1), процесс катаболизма липидов, липидный гомеостаз (ген ABHD4), процесс биосинтеза жирных кислот (ген MLYCD), метаболический процесс длинноцепочечных жирных кислот (CYP1A1), процесс биосинтеза гемоглобина (ген ALAS1), метаболический процесс углеводов (ген AMDHD2) и процесс биосинтеза холестерина (гены TM7SF2, DHCR7).
- Клеточные процессы, мышцы, ткани и кости — дифференцировка бурых жировых клеток (гены ARL4A, EBF2), регуляция минерализации костей (ген TWIST1), развитие жировой ткани (ген EBF2), развитие поперечно-полосатых мышечных клеток (ген SDC1), положительная регуляция пролиферации клеток сердечной мышцы, дифференцировка эпителиальных клеток молочной железы (ген FGF2), сокращение гладких мышц (ген CHRNB4), связывание ионов металлов (ген CRIP2), развитие эритроцитов (ген ALAS1), клеточный процесс метаболизма аминокислот (ген ACY1), сокращение мышц (ген NTN3).
- Иммунитет — иммунный ответ (ген IL21), врожденный иммунный ответ (гены UBL7, TLR9).
- Репродуктивные свойства и эмбриональное развитие — репродуктивный процесс (ген ABHD4), внутриутробное эмбриональное развитие, развитие плаценты (ген HSD17B2), сперматогенез (ген PRSS21).
Один не вошел ни в одну из групп — ген BBS12, отвечающий за кормовое поведение животных. По исследованиям Т. Chang и др., данный ген связан с выходом мяса, массой передней голяшки у китайского симментальского мясного скота.
Интенсивное развитие молекулярно-генетических методов в последние четверть века открывает новые возможности в ускорении прогресса в селекции животных от определения отдельных генов, контролирующих единичные физиологические процессы, до локусов количественных признаков (QTL) — регионов в геноме, ответственных за наследование признаков, и однонуклеотидных замен или точечных мутаций (SNP), маркирующих комплекс продуктивных качеств животного, в связи с чем был проведен анализ выявленных генов по базе QTL крупного рогатого скота и свиней, после которого остались только 13 генов, ранее встречающихся в научных исследованиях (табл. 4). Так, ген LRP2, выявленный при GWA-анализе на телках голштинской породы, ассоциирован с числом осеменений до стельности и экстерьерным признаком — бороздой вымени. Ген SCIN (TNC) в популяции товарных гибридов второго поколения взаимосвязан с цветом мяса. Интерес представляет ген ANTXR1, который ассоциирован с выходом (процентом) молочного жира в популяции молочного скота датской голштинской и джерсейской породы. Остальные гены хоть и ассоциированы с цветовыми характеристиками мяса и жира крупного рогатого скота абердин-ангусской породы и имеют научное доказательство с другими признаками у животных, но не имеют конкретной точки замены SNP (внутри гена не найдена), в связи с чем для их практического применения необходимы дополнительные исследования.
Выводы
Проведение генетического анализа цветовых характеристик мяса и жира говядины для выявления маркерной основы и точечной замены нуклеотида является интересной и практико-обоснованной задачей. В данном исследовании были взяты фактические данные, полученные при измерении спектров мяса и жира опытной популяции крупного рогатого скота абердин-ангусской породы. Полногеномное ассоциативное исследование и аннотация полученных SNP и сцепленных с ними регионов (±0,2 Мб) выявили наличие 25 генов по цветовым спектрам мяса и 26 — по жировой ткани. Из них 3 гена представляют особый интерес в дальнейшем использовании — гены LRP2, SCIN и ANTXR1, так как в них находятся выявленные SNP, и они ассоциированы со значимыми показателями, а именно с фертильностью, цветом мяса и выходом молочного жира. В дальнейшем по данным генам необходимо провести оценку влияния их генотипов на хозяйственно полезные признаки и смоделировать тест-системы и (или) мультиплексные панели, а также провести массовый скрининг на разных популяциях крупного рогатого скота мясного и молочного направлений продуктивности.
Об авторах
Анна Александровна Белоус1; кандидат биологических наук, доцент
belousa663@gmail.com; https://orcid.org/0000-0001-7533-4281
Александр Александрович Сермягин1; кандидат сельскохозяйственных наук, заведующий отделом популяционной генетикии генетических основ разведения животных
alex_sermyagin85@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-1799-6014
Николай Павлович Елаткин2; кандидат биологических наук, генеральный директор
n.elatkin@agrohold.ru
Наталия Анатольевна Зиновьева1; доктор биологических наук, академик Российской академии наук, профессор, директор
priemnaya-vij@mail.ru; orcid.org/0000-0003-4017-6863
1Федеральный исследовательский центр животноводства — ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста, пос. Дубровицы, 60, г. о. Подольск, Московская обл., 142132, Россия
2ООО «Мираторг-Генетика», ул. Нобеля, д. 5, эт. 2, пом. 7, раб. 3, территория инновационного центра Сколково, Москва, 121205, Россия
УДК 636.3:576:591.8
DOI: 10.32634/0869-8155-2024-383-6-68-76
