Идентификационные критерии напитков на основе чая
На фоне неблагополучной экологической ситуации во многих регионах нашей страны большой интерес вызывает производство продуктов питания, в том числе безалкогольных напитков на основе чая, содержащих биологически активные компоненты — катехины, аминокислоты, чайные пигменты, кофеин и чайные полисахариды. Многие из них способны подавлять процессы перекисного окисления в организме человека и тем самым снижать риск возникновения ряда патологических состояний.
Очевидно, что для данного вида продукции особенно важен контроль соответствия заявленному составу, так как все биологически активные вещества чая вносят вклад в ее уникальные свойства. Разработка действенных методов борьбы с фальсификациями, связанными с подменой сырья, является сложной и актуальной задачей пищевой безопасности. В случае безалкогольных напитков на основе чая для подтверждения их подлинности целесообразно в качестве идентификационных критериев использовать содержание специфических компонентов чая — катехинов и теанина. Известно, что данную задачу можно решить с привлечением ДНК-технологий.
Основные методологические подходы к геноидентификации сырьевого состава безалкогольных напитков на основе чая изложены в работе ряда ученых, в которой показано, что геноидентификация сырьевого состава безалкогольных напитков на основе чая включает наработку ПЦР-продукта с праймерами, инициирующими амплификацию локуса хлоропластной ДНК чайного сырья, а также последующее проведение анализа ПЦР-ПДРФ с подобранными рестриктазами или прямое секвенирование.
Цели работы — апробация предложенного ранее комплексного подхода для идентификации чайного сырья в безалкогольных напитках, а также идентификация других видов растительного сырья (иван-чая и лимона).
Материалы и методы исследования
Работа проведена в Межотраслевом научно-техническом центре мониторинга качества пищевых продуктов Всероссийского научно-исследовательского института пивоваренной, безалкогольной и винодельческой промышленности — филиала «ФГБНУ ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова» РАН (г. Москва, Россия).
Объекты экспериментального исследования: водные экстракты зеленого чая и иван-чая; мякоть лимона; опытные образцы безалкогольных напитков: образец на основе чая черного (монокомпонент), образец на основе чая зеленого (монокомпонент) и образец на основе зеленого чая с добавлением других видов растительного сырья; промышленные образцы безалкогольных напитков из розничной торговой сети: образец на основе зеленого чая с соком лимона, образец на основе зеленого чая с добавлением других видов растительного сырья, образец на основе иван-чая, образец на основе гуараны. Для создания опытных образцов безалкогольных напитков на основе чая использовали ранее разработанную учеными института запатентованную базовую технологию, включающую водно-ферментно-спиртовый гидролиз смеси растительного сырья при заданных технологических параметрах, инактивирование ферментов, получение концентрата поликомпонентного.
Испытания образцов безалкогольных напитков проведены методом жидкостной хроматографии на приборе Thermo Scientific Vanquish Fex UHPLC (Dionex, США) с автоматическим инжектором и диодно-матричным детектором. Определение L-теанина проводили при 37 ºC в изократическом режиме; колонка: Merck C18 Purospher Hibar-STAR (250 × 4,6 мм, 5 мкм); подвижная фаза: 0,1%-ный водный раствор H3PO4 (pH 3,5). Cкорость потока подвижной фазы — 0,3 мл/мин.
Детекцию L-теанина проводили при λ = 210 нм, определение кофеина — в изократическом режиме; колонка: Luna 5u C18 (150 × 3,0 мм, 5 мкм); подвижная фаза: ацетонитрил — 0,1%-ный водный раствор H3PO4 (10:90; pH 3,5). Скорость потока подвижной фазы — 0,5 мл/мин. Детекцию кофеина проводили при λ = 280 нм.
Выделение ДНК из экстрактов и безалкогольных напитков выполнено комплектом реагентов для экстракции нуклеиновых кислот из биологического материала «ДНК-сорб-С-М» («АмплиСенс», Россия).
Постановка ПЦР с экстрагированными образцами ДНК осуществлена с применением набора реактивов Encyclo Plus PCR kit («Евроген», Россия) и праймеров (#1 и #2) в термоциклере «Терцик» («ДНК-технология», Россия) в следующем режиме: ×1: 95 °С — 5 мин.; ×40: 95 °С — 10 сек., 61 °С — 10 сек., 72 °С — 10 сек.; ×1: 72 °С — 1 мин.
Процедура эндонуклеазного расщепления амплифицированных ПЦР-продуктов проведена инкубированием проб ПЦР-ПДРФ в течение 4 часов c рестриктазой TaqI (10 ед.) в 1× SE-буфере Y при 65 °С, рестриктазой BtrI (1 ед.) в 1× SE-буфере O при 60 °С, рестриктазой HinfI (5 ед.) в 1× SE-буфере О («СибЭнзим», Россия) при 37 °С.
Электрофоретическое разделение цельных и расщепленных ампликонов выполнено в камере для горизонтального электрофореза SE-1 («Хеликон», Россия) с применением 2,5%-ной агарозы в окрашенном ТАЕ-буфере.
Последующая визуализация электрофореграмм осуществлена в трансиллюминаторе ECX-F15.M (Vilber Lourmat, Франция).
Для обработки экспериментальных данных использовали методы математической статистики в программном обеспечении Microsoft Excel 2016 (США).
Результаты и обсуждение
Ранее авторами был предложен комплексный подход для идентификации чайного сырья в безалкогольных напитках. На рисунке 1 представлена схема данного подхода. Кофеин, кроме чая, содержится лишь в немногих растительных источниках: кофе, какао, падубе парагвайском (мате), падубе китайском (кудине), гуаране, коле. L-теанин — это аминокислота, которая содержится преимущественно в чайных листьях.
Скрининг испытуемых образцов сначала на содержание кофеина, а затем на содержание L-теанина позволяет выявить возможные фальсификаты, содержащие, например, вместо экстракта зеленого чая экстракт иван-чая, а также отобрать образцы для дальнейших молекулярно-генетических исследований методом ПЦР в сочетании с ПДРФ-анализом.
В таблице 1 представлены содержание кофеина и L-теанина, а также их соотношение для ряда безалкогольных напитков. Последний показатель по сравнению с предложенным ранее «Концентрация L-теанина» является более чувствительным к содержанию в напитках чайного сырья. Из таблицы 1 видно, что все исследованные напитки содержат L-теанин, однако его содержание, например, в напитке на основе гуараны, значительно ниже, чем в напитках на основе чая, при этом отношение концентрации кофеина к концентрации L-теанина для напитков на основе чая находится в пределах 5–30, а для напитка на основе гуараны оно может превышать 700.
Как следует из схемы (рис. 1), если в испытуемом безалкогольном напитке присутствует кофеин и содержится L-теанин в концентрации, близкой к 1,5 мг/л (1,4–1,6 мг/л), то этот образец должен был дополнительно исследован молекулярно-генетическими методами. Промышленный напиток на основе зеленого чая и дополнительного растительного сырья (табл. 1) содержит 1,5 мг/л L-теанина. Заявленное на этикетке данного образца дополнительное растительное сырье требует поиска в биоинформационном ресурсе GenBank NCBI нуклеотидных последовательностей локуса хлоропластной ДНК этих растений для подбора условий ПЦР-ПДРФ. Подтвердить присутствие чайного сырья в данном образце пока не удалось.
В иван-чае отсутствуют кофеин, пуриновые основания, щавелевая и мочевая кислоты — вещества, которыми богат традиционный чай (Camelliasinensis) и которые способствуют нарушению обмена веществ, поэтому напитки на основе данного сырья легко отличить от напитков на основе чая. Для этой цели можно использовать молекулярно-генетические методы, поскольку профили ПЦР-ПДРФ экстрактов чая и иван-чая, полученные при использовании рестриктаз TaqI и BtrI, различаются (рис. 2а). Вытяжки из лимона могут использоваться в качестве дополнительных компонентов при производстве безалкогольных напитков на основе чая. Поскольку профили ПЦР-ПДРФ экстрактов чая (рис. 2а) и мякоти лимона (рис. 2б), полученные при использовании рестриктазы TaqI, достаточно хорошо различаются (разница составляет 58 bp), то можно ожидать, что при совместном присутствии ДНК чая и лимона в безалкогольном напитке их можно будет идентифицировать.
Следует отметить, что в результате анализа ПЦР-ПДРФ образцов нуклеиновых кислот, выделенных из экстрактов чая (Camelliasinensis), иван-чая (Chamaenerionangustifolium) и мякоти лимона (Citrus limon), получены фрагменты, полностью совпадающие с теоретически рассчитанными, что подтверждает происхождение исследованных экстрактов из соответствующих видов растительного сырья.
На рисунке 3 представлены результаты анализа ПЦР-ПДРФ образцов нуклеиновых кислот, выделенных из промышленных образцов напитков на основе чая с экстрактом лимона и на основе иван-чая, приобретенных в розничной торговой сети. Видно, что в данных напитках идентифицируются соответствующие фрагменты, характерные для чая, лимона и иван-чая (рис. 2а и 2б), причем в случае напитка на основе чая и экстракта лимона оба компонента обнаруживаются при совместном присутствии.
В результате данной работы удалось подтвердить присутствие чайного сырья в четырех образцах и его отсутствие в двух образцах. В одном образце не удалось подтвердить присутствие чайного сырья, вероятно, из-за мешающего влияния содержащегося в нем другого растительного сырь. Или же данный образец является фальсификатом. Кроме того, подтверждено молекулярно-генетическим методом присутствие иван-чая в составе сырья одного образца и присутствие лимона (совместно с чаем) в составе одного образца. Таким образом, в процессе работы не только идентифицирован чай в составе безалкогольных напитков, но и два вида другого растительного сырья — иван-чай и лимон причем лимон идентифицирован при совместном присутствии с чаем.
Выводы
Предложенный ранее комплексный подход для идентификации безалкогольных напитков на основе чая, включающий хроматографические (определение кофеина и L-теанина) и молекулярно-генетические (определение маркерных фрагментов ДНК чая) методы, протестирован на ряде опытных и промышленных безалкогольных напитков.
Показано, что использованный анализ ПЦР-ПДРФ с подобранными рестриктазами TaqI, BtrI и HinfI позволяет идентифицировать не только чайное сырье (Camellia sinensis) в составе безалкогольных напитков, но и иван-чай (Chamaenerion angustifolium) и дополнительные компоненты, например лимон (Citrus limon), при его совместном присутствии с чаем.
Данная работа имеет практическое значение, поскольку позволяет дифференцировать растительное сырье безалкогольных напитков, тем самым повышая эффективность выявления фальсифицированной продукции.
Об авторах
Екатерина Владимировна Ульянова 1, кандидат химических наук
k.uljanova@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-7112-1614
Ирина Юрьевна Михайлова 1, научный сотрудник
irina-mikhailova54@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-9180-1043
Константин Георгиевич Саббатовский 2, кандидат химических наук
sabbat07@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-0201-8725
1 Всероссийский научно-исследовательский институт пивоваренной, безалкогольной
и винодельческой промышленности — филиал Федерального научного центра пищевых систем
им. В.М. Горбатова Российской академии наук, ул. Россолимо, 7, Москва, 119021, Россия
2 Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина Российской академии наук,
Ленинский пр-т, 31, корп. 4, Москва, 119071, Россия
УДК 663.95: 57.088.1
DOI: 10.32634/0869-8155-2025-395-06-156-161
Просмотров: 217
