Генотипирование родового комплекса Caragana, произрастающего на территориях с аридным климатом с применением ISSR-маркеров
Основным направлением повышения жизнеспособности и долговечности искусственных насаждений в аридном регионе являются селекционно-генетические приемы их создания. В настоящее время изучение биологического разнообразия и морфологических особенностей родовых комплексов древесно-кустарниковых растений сопровождается оценкой их молекулярно-генетических параметров, на основе которых могут быть созданы «уникальные» биоресурсные коллекции.
В связи с необходимостью исключения ошибок в маркировке родословных деревьев на лесосеменных плантациях лесообразующих видов для продолжения селекционного процесса необходимо осуществить генотипирование.
Caragana Lam. относится к семейству бобовых (Fabaceae), объединяет более 70 видов, жизненная форма этого рода представляется листопадным кустарником различной высоты со сложными парноперистыми листьями с мелкими листочками. Во время цветения видны ярко-желтые цветочки. Плоды узкие, бурые, линейно-цилиндрические стручки. Когда плод созревает в июле — августе, стручок скручивается и раскрывается, выбрасывая семена в форме боба. Родом кустарник из Алтая, встречается на Южном Урале, в Восточном и Центральном Казахстане, на Кавказе.
Caragana быстро приспосабливается к климатическим условиям среды произрастания. Является ценным объектом для агролесомелиорации, обладающим всеми нужными характеристиками, такими как длинный и мощный стержневой корень с придаточными корнями, морозоустойчивость и засухоустойчивость.
Учеными ФНЦ агроэкологии РАН ранее была выведена новая форма Caragana arborescens f. pyramidalis «Несравненная ВНИАЛМИ» с более высокой засухоустойчивостью. Рекомендуется для посадки в зеленых лесных насаждениях различного назначения и в качестве декоративного сорта для озеленения (аллейные и групповые посадки, солитеры).
Для генотипирования родового комплекса Caragana в настоящий возможно провести только с помощью неспецифических маркеров, так как геном исследуемых объектов, произрастающих на территории с аридным климатом, не секвенирован. Особенностью маркер-опосредованного анализа является возможность его проведения на любом этапе развития растения.
В связи с этим среди неспецифических маркеров наилучшим будет являться ISSR. ISSR-маркеры являются неспецифическими маркерами мультилокусного типа, амплифицирующие фрагменты ДНК разных длин пар нуклеотидов. Данные участки находятся в геноме между микросателлитами. ISSR-маркеры лучше всего подходят для генотипирования и эффективны при отсутствии специфичных маркеров.
Цель исследования — проведение генотипирования родового комплекса Caragana с использованием ISSR на территории с характерным аридным климатом.
Материалы и методы исследования
Оценку жизненного состояния проводили в 2024 г. на 2-пробных площадках на территории Кировского селекционно-семеноводческого комплекса (ССК) (г. Волгоград, Россия) по 5-балльной шкале категорий жизненного состояния по визуальным характеристикам кроны по методике В.А. Алексеева. Если выбранная особь соответствует критериям здорового кустарника, то относится к 1-му классу жизненного состояния.
Для генотипирования были взяты по 30 особей С. аrborescens, С. frutex и С. arborescens f. pyramidalis сорта «Несравненная ВНИАЛМИ» с каждой площадки в возрасте 23 и 24 лет, соответственно, в начале периода активной вегетации.
В 2004 году сорт прошел сортоиспытание на коллекционном участке Волгоградского лесхоза и был включен в Госреестр по Российской Федерации (№ 9553689). Авторами данного кустарника выступают С.Н. Крючков и Г.П. Архангельская (авторское свидетельство № 42281) (рис. 1).
Образцы листовой пластинки С. аrborescens, С. frutex и С. arborescens f. Pyramidalis сорта «Несравненная ВНИАЛМИ» сразу же помещались в холод и были транспортированы в лабораторию для хранения при t = 20 °С.
Геномную ДНК экстрагировали из образцов листьев массой 50 мг с использованием ЦТАБ с 0,2%-ным β-меркаптоэтанолом. Концентрация и качество (А260/А280) ДНК оценивались с помощью флуориметра Qubit 4.0. (Thermo Fisher Scientific Inc., США) и спектрофотометра SpectrostarNano (BMG Labtech, Германия).
Для проведения ПЦР была использована готовая смесь реагентов для ПЦР с красителями qPCRmix-HS (Евроген) согласно инструкции производителя с ISSR-праймерами (табл. 1).
ПЦР проводили с помощью системы Applied Biosystems QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific, США) со следующим режимом: предварительная денатурация при t = 95 °С (10 мин.); 40 циклов амплификации: денатурация при t = 95 °С (30 с.), отжиг при t = 50 °С (30 с.), элонгация при t = 72 °С (60 с.), финальная элонгация при t = 72 °С (10 мин.).
Электрофорез полученных ампликонов проводили в 2%-ном агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием. Для определения длины фрагментов ДНК использовался ДНК-маркер, Step50 plus («Биолабмикс», Россия).
Для визуализации результатов реакции после электрофореза использовали гель-документирующую систему iBright CL1500 (Thermo Fisher Scientific Inc., США).
Частоту полиморфизмов и количество полос, образуемых каждым праймером, рассчитывали индивидуально с учетом 3-кратной амплификации каждого выбранного ISSR-маркера. Локусы ПЦР на основе ISSR оценивались как присутствующие 1 или отсутствующие 0, каждый из которых рассматривался как независимый.
Полученные бинарные матрицы использовались для расчета характеристик связывания праймеров в программе POPGENE версии 1.31.
Результаты и обсуждение
С. arborescens L. — многоствольный кустарник (8–15 побегов) высотой около 3,5 ± 0,2 м с выраженной эллиптической формой проекции кроны. Цветение хорошее, плодоношение массовое. Жизнеспособность — 1-й класс.
С. frutex L. — многоствольный кустарник с тонкими побегами высотой около 1,7 ± 0,3 м с выраженной округлой яйцевидной формой проекции кроны. Цветение хорошее, плодоношение массовое. Жизнеспособность — 1-й класс.
С. arborescens f. Pyramidalis сорта «Несравненная ВНИАЛМИ» представляет собой быстрорастущее многоствольное дерево (7–12 побегов) средней величины (до 5,0 м) с узкопирамидальной ажурной кроной (проекция кроны 4,0 х 4,0 м). Цветение слабое, плодоношение единичное. Жизнеспособность — 1-й класс. Сорт характеризуется комплексной устойчивостью к неблагоприятным факторам среды.
Для генотипирования родового комплекса Caragana были использованы 12 ISSR-праймеров. На первом этапе было оценено их жизненное состояние. В ходе оценки Caragana двух форм кустарниковой и древовидной и C. arborescens f. pyramidalis сорта «Несравненная ВНИАЛМИ» не было обнаружено внешних повреждений кроны. Не выявлено болезней и вредителей. Мертвые или усыхающие ветви не обнаружены.
Прохождение фенологических фаз развития — в пределах многолетних среднестатистических наблюдений. В связи с этим жизненное состояние растений было оценено на 5 баллов.
Выделенная ДНК из листовых пластинок представителей родового комплекса Caragana обладала высокими качественными показателями при длинах волн ƛ260/280 и ƛ260/230 и достаточной концентрацией для проведения ПЦР.
Для выявления внутривидового генетического разнообразия Caragana были протестированы 12 ISSR-праймеров у исследуемых форм.
Для детализации эффективности примененных ISSR-праймеров была проведена оценка частоты встречаемости по каждому локусу у трех форм Caragana, полученных с помощью электрофореза ампликонов.
Каждый анализируемый локус ISSR-маркера формировал специфичный спектр продуктов амплификации особей С. frutex, C. arborescens и C. arborescens f. pyramidalis сорта «Несравненная ВНИАЛМИ» (рис. 2, 3).
В ходе анализа электрофореграмм было выявлено наличие однотипных локусов при использовании 811, 890 ISSR-праймеров между особями С. frutex, C. arborescens и C. arborescens f. pyramidalis сорта «Несравненная ВНИАЛМИ». Остальные 10 ISSR-маркеров показали наличие отличий между исследуемыми формами Caragana. В частности, у С. frutex был отмечен уникальный локус 500 п. н. при использовании UBC 815. Для C. arborescens был обнаружен уникальный локус 650 п. н. при использовании UBC 823. Локусы у трех форм Caragana при использовании UBC 840 были высокополиморфными между всеми особями.
Далее была произведена оценка параметров генетической изменчивости особей С. frutex, C. arborescens и C. arborescens f. pyramidalis сорта «Несравненная ВНИАЛМИ» (табл. 2).
У особей C. arborescensпоказатели среднего абсолютного числа аллелей были выше в 1,2 раза по сравнению с другими формами, при этом наименьшим значением обладала C. arborescens f. pyramidalis сорта «Несравненная ВНИАЛМИ». Эффективное число аллелей на локус было очень близко между формами родового комплекса Caragana. Это в свою очередь демонстрирует большую вариабельность генетической структуры. Расчетный индекс Шеннона был выше в 1,8 раза и 1,3 раза у особейC. arborescensпо сравнению с C. arborescens f. pyramidalis сорта «Несравненная ВНИАЛМИ» и С. frutex соответственно. Высокое значение полиморфизма локусов было зафиксировано у особейC. Arborescens, в то время как наименьший показатель — у C. arborescens f. pyramidalis сорта «Несравненная ВНИАЛМИ», что подтверждает ее моноклональность. Высокий полиморфизм может быть связан с устойчивостью и большей пластичностью особей C. arborescensпо сравнению сС. frutexи C. arborescens f. pyramidalis сорта «Несравненная ВНИАЛМИ».
Полученные результаты с высокой вероятностью указывают на моноклональность насаждений C. arborescens f. pyramidalis сорта «Несравненная ВНИАЛМИ», для которых уникальными локусами являются UBC 880 (1100 п. н.) и UBC 818 (450 п. н.). Для C. arborescens — UBC 823 (650 п. н.), у С. frutex — UBC 815 (500 п. н).
Таким образом, из 12 протестированных праймеров только 2 могут быть использованы для выявления особей с характерными фенотипическими признаками C. arborescens f. pyramidalis сорта «Несравненная ВНИАЛМИ» от других представителей родового комплекса.
Проведенное исследование подтверждает теорию о том, что C. arborescens f. pyramidalis сорта «Несравненная ВНИАЛМИ» является моноклональным растением и при этом обладает устойчивостью к засухе, как и C. arborescens. В связи с вышесказанным C. arborescens f. pyramidalis сорта «Несравненная ВНИАЛМИ» является перспективным объектом для селекции и решения задач агролесомелиорации и защитного лесоразведения на территориях с засушливым климатом.
Выводы
Исследование показало, что локусы UBC 880 (1100 п. н.) и UBC 818 (450 п. н.) могут являться маркерами C. arborescens f. pyramidalis «Несравненная ВНИАЛМИ», для С. frutex — UBC 815 (500 п. н.), для C. arborescens —UBC 823 (650 п. н.). Полученные результаты подтверждают успех данного сорта, его высокую устойчивость к засухе. C. arborescens f. Pyramidalis «Несравненная ВНИАЛМИ» может быть рекомендована для защитного лесоразведения и агролесомелиорации засушливых районов.
Об авторах
Елена Владимировна Калмыкова; доктор сельскохозяйственных наук, доцент, главный научный сотрудник, заведующая лабораторией биоэкологии древесных растений
kalmukova-ev@vfanc.ru; https://orcid.org/0000-0001-8530-9995
Пётр Анатольевич Кузьмин; кандидат сельскохозяйственных наук, ведущий научный сотрудник, заведующий лабораторией молекулярной селекции
kuzmin-p@vfanc.ru; https://orcid.org/0000-0002-1303-765X
Елизавета Сергеевна Лушникова; лаборант-исследователь лаборатории молекулярной селекции
lushnikova-e@vfanc.ru
Павел Андреевич Крылов; кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник — заведующий лабораторией геномных и постгеномных технологий
krylov-p@vfanc.ru; https://orcid.org/0000-0001-9587-5886
Федеральный научный центр агроэкологии, комплексных мелиораций и защитного лесоразведения Российской академии наук, Университетский пр-т, 97, Волгоград, 400062, Россия
УДК 581.5:630.271
DOI: 10.32634/0869-8155-2024-389-12-140-144
