Гаплотипы фертильности маточного поголовья крупного рогатого скота в Cвердловской области
Генетические маркеры, связанные с эмбриональной, постэмбриональной смертностью и долей успешных осеменений, называются гаплотипами фертильности. Для голштинской породы описаны 10 таких маркеров.
BLAD — летальное аутосомно-рецессивное заболевание, которое, как известно, встречается у крупного рогатого скота голштинской породы во всем мире. Болезнь появилась в результате миссенс-мутации в гене CD18, приведшей к замене аспарагиновой кислоты в позиции 128 на глицин в мембранном белке β2-интегрин. Вследствие мутации экспрессия белка снижается, что влечет за собой нарушение адгезии лейкоцитов. Проявляется иммунная недостаточность слизистых оболочек. Гомозиготы по данному синдрому погибают в возрасте до одного года.
В Российской Федерации в регионах зафиксирована различная частота встречаемости носительства синдрома BLAD. В различных регионах Российской Федерации выявлены следующие доли носителей: Свердловская область — 3,6%; Ленинградская область — 2,6%; Хабаровский край — менее 1%; Республика Татарстан — носителей не обнаружено.
Исследование общего поголовья Российской Федерации выявило долю гетерозигот по данному синдрому на уровне 2,94%. Гаплотип HH1 связан с нонсенс-мутацией в гене APAF1 (апоптотический протеаза-активирующий фактор 1), которая приводит к замене аминокислоты глутамина в позиции 579 на стоп-кодон. APAF1 играет ключевую роль в правильном эмбриональном развитии, так как инициирует процессы апоптоза. Следовательно, гаплотип HH1 на различных этапах беременности влияет на эмбриональную смертность. Причиной гаплотипа HH3 является миссенс-мутация в позиции 1135 с фенилаланина на серин в домене НТФазы — белка структурной поддержки хромосом 2 (гене SMC2).
Белок SMC2 играет ключевую роль в процессе конденсации хромосом, их разделении во время клеточного деления и репарации ДНК. Данный гаплотип в рецессивном гомозиготном состоянии приводит к эмбриональной гибели в течение первых 60 суток беременности. HH4 вызван миссенс-мутацией, в результате которой в гене GART (фосфорибозилглицинамид-синтетаза) происходит замена аспарагина на треонин в позиции 290 и данная мутация вызывает гибель эмбриона.
GART критически важен для нормального эмбрионального развития, поскольку участвует в синтезе пуриновых оснований. Генотипирование российского поголовья голштинизированного черно-пестрого показало, что 1,83% являются носителями дефектного аллеля APAF1, 2,98% — SMC2, 1,04% — GART. В другом исследовании в отечественной популяции молочного скота обнаружены 6,39% носительниц HH1, 1,48% — HH3, 0,52% — HH4.
DUMPS — это патология, возникающая в результате миссенс-мутации цистеина в позиции 405 на тирозин в ферменте уридин-5′-монофосфат синтазы (UMPS). Этот фермент катализирует реакцию превращения оротовой кислоты в предшественника цитозина и тимина. Вследствие нарушения синтеза азотистых оснований процессы деления клеток прекращаются и эмбрион-мутант погибает в течение месяца с начала беременности.
В Российской Федерации, согласно работе Khatib et al. (2020 г.), мутация DUMPS не обнаружена. Нонсенс-мутация в гене ASS1, приводящая к появлению в соответствующем белке стоп-кодона на 86-й позиции вместо аланина, — причина развития цитруллинемии. Образование стоп-кодона приводит к недостаточной активности фермента аргининосукцинатсинтазы, в крови повышается уровень аммиака из-за нарушения цикла мочевины. Синдактилию, или мулфут, у голштинского скота связывали с двумя миссенс-мутациями в 33-м экзоне гена LRP4: первая приводит к замене в позиции 1621 аспарагина на лизин, а вторая в позиции 1647 — пролина на лизин в белке LRP4, однако в более поздней работе того же коллектива авторов связь последней мутации и заболевания была исключена.
Болезнь приводит к сращению функциональных фаланг у крупного рогатого скота, что затрудняет или делает невозможным содержание больных животных. Бычья разветвленная кардиомиопатия (BDCMP) вызвана нонсенс-мутацией в гене OPA3, в результате в 115-й позиции соответствующего белка глутамин заменяется на стоп-кодон. Из-за мутации развивается патология миокарда, что в итоге приводит к тяжелой правосторонней сердечной недостаточности из-за систолической дисфункции сердечной мышцы, а сердце увеличивается в два раза из-за расширения обоих желудочков. Животные-мутанты в некоторых случаях погибают в течение года жизни, а средняя продолжительность жизни составляет от 2 до 4 лет.
Цель данной работы — определить наличие и распределение носителей летальных мутаций (BLAD, HH1, HH3, HH4) и других генетических патологий (синдактилия, цитруллинемия, DUMPS) среди маточного поголовья скота молочного направления продуктивности в Свердловской области.
Материалы и методы исследования
Исследование проводили в четырех племенных организациях Свердловской области. Организации были сходны по условиям содержания, кормления. С 2008 по 2014 год в отобранных племенных организациях использовали одного поставщика спермопродукции.
Для генотипирования отбирали кровь из подхвостовой вены в пробирки с ЭДТА. В каждой организации в группу исследования были отобраны 48 половозрастных коров 2008–2013 гг. рождения, что составило 5–10% от маточного поголовья.
Выделение ДНК проводили с помощью набора «ДНК-Экстран-1» (ООО «Синтол», Россия) в соответствии с предложенной в инструкции методикой. Генотипирование экстрагированной ДНК на чипах GGP Bovine 150K (Illumina, США) проводили в Центре коллективного пользования научным оборудованием «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» на базе ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста (г. Подольск). Дальнейшая биоинформатическая обработка сырых данных была проведена специалистами лаборатории молекулярных и биологических исследований ФГБОУ ВО Уральский ГАУ (г. Екатеринбург).
Исследования проводились с соблюдением требований, изложенных в Директиве Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22 сентября 2010 года № 2010/63/ЕС о защите животных, использующихся для научных целей, и принципов обращения с животными, согласно статье 4 ФЗ РФ № 498-ФЗ.
Данные о происхождении образцов были взяты из базы ИАС «СЕЛЭКС» (Россия). Родословную быков, отцов исследуемой популяции коров, реконструировали по каталогам племенной организации по искусственному осеменению (Россия) и базы данных STgenetics (США).
Полученные данные биометрически обрабатывали в среде программирования R, там же проводили точный тест Фишера — fisher.test.
Результаты и обсуждение
В исследованной популяции крупного рогатого скота Свердловской области было обнаружено носительство по пяти маркерам летальных мутаций из восьми (табл. 1). Не были выявлены маркеры синдактилии, цитруллинемии и DUMPS.
Наиболее распространен в исследованном поголовье мутантный аллель гена APAF1. Обнаружены 14 носителей этого варианта гена, его частота составляет 0,037. Коров — носительниц гаплотипов фертильности BLAD и HH3 выявлено по 7 голов с частотой соответствующего аллеля 0,018. Выявлены шесть особей, гетерозиготных по гаплотипу HH4, и частота встречаемости соответствующего мутантного аллеля в популяции равна 0,016. По маркеру BDCMP была обнаружена лишь одна гетерозиготная корова.
Полученные результаты соответствуют ранним исследованиям носительства летальных мутаций крупного рогатого скота в Российской Федерации. Доли носительства BLAD остаются достаточно высокими в Свердловской области по сравнению с другими регионами Российской Федерации. Та же картина наблюдается с HH1, HH3 и HH4, доли носительства которых превышают таковые по России.
Оценка равновесия частот аллелей и генотипов методом хи-квадрат показала, что наблюдаемые генотипы соответствуют ожидаемым
Наблюдаются различия в долях коров-носительниц между сельхозорганизациями, результаты представлены в таблице 2. Причина большей распространенности летальных мутаций в одних сельхозорганизациях и меньшей в других при общих равных может быть следствием зоотехнической работы в конкретных хозяйствах. В частности, зоотехник при подборе быков-производителей может руководствоваться необходимостью решения конкретных задач (например, повышения качества молока или улучшения экстерьерных характеристик потомства) либо ставит во главу угла легкость отела и т. д.
Всё это приводит к преобладанию в различных сельскохозяйственных организациях потомков одних быков над другими. Так, на племенную организацию № 2 приходится свыше 57% от общего числа носительниц синдрома BLAD и более 64% случаев носительства гаплотипа HH1, свыше 83% всех носителей летального заболевания HH4 наблюдаются в племенной организации № 1. Только HH3 встречен в приблизительно равных пропорциях (57% и 43%) в племенной организации № 3 и племенной организации № 4 соответственно.
Общее число генотипированных особей для целей исследования в каждом предприятии составляло 48 голов из этого числа: 8,3% в племенной организации № 3 являлись носительницами рецессивного заболевания HH3; 10,4% оказались гетерозиготны по гаплотипу HH4 в племенной организации № 1; почти пятая часть исследованного молочного скота в племенной организации № 2 была гетерозиготна по маркеру HH1. Наиболее распространенными оказались маркеры BLAD и HH1, встреченные сразу в трех организациях.
В ходе исследования выявили племенных быков, которые потенциально являются носителями летальных мутаций и имеют более трех гетерозиготных потомков. Гипотезу о носительстве летальных мутаций среди быков-производителей проверили методом точного теста Фишера. Для этого из прогенотипированных особей выделили носительниц и их здоровых сестер. Влияние генотипа матери в данном случае считали минимальным; все дочери одного отца были от разных матерей. Наблюдаемые количества гетерозигот в потомстве быка сравнивали с ожидаемым количеством гетерозигот, полученных в результате скрещивания гомозиготы (мать) с гетерозиготой (отец). В таблице 3 представлены результаты анализа.
С вероятностью свыше 50% носителями гаплотипа HH1 являются быки Луч (3) и Твин (3602), гаплотипа HH3 — Дент (2244592261) и Маркус (150530), гаплотипа HH4 — Ярус (51091672). Большинство потомков Луча и Твина находились в ПО № 2, Дента — в ПО № 3 и 4, Яруса — в ПО № 1. Провели исследование родословной этих быков, используя каталоги племенной организации по искусственному осеменению и базу данных STgenetics. Так, выяснилось, что мать отца матери — Дента Meier-Meadows EL Jezebel-ET (HOUSA000015459080) — носительница летали HH3. Отец отца Твина Shen-Val NV LM Formation-Et (HOUSA000002163822) оказался носителем мутантного аллеля HH1. Отец отца Яруса был Jocko Besne (HOFRA005694028588), через которого пошло широкое распространение гаплотипа HH4 [Зиновьева, 2016 г.]. В родословной по отцовской линии быка Маркуса носители обнаружены не были, провести поиск материнской линии не удалось. Родословную Луча установить не удалось. Упрощенное генеалогическое древо быков с предполагаемым носительством, включающее только предков-носителей, представлено на рисунке 1.
Стоит отметить, что при проверке каталогов племенной организации по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных с 2014 по 2021 год последним быком, семя которого еще представлено в каталоге на момент 2016 года, был Дент (2244592261). После 2016 года быки либо их потомки, которые, по заключению авторов, могут быть потенциальными носителями, более не представлены в каталогах данной племенной организации.
Выбытие быков в первую очередь связано с введением обязательного генетического тестирования быков-производителей. Однако летальные гены могут долгое время сохраняться в поголовье за счет коров-носительниц.
Выводы
Проведенное авторами генотипирование полновозрастного поголовья молочного направления продуктивности по четырем племенным организациям в поголовье Свердловской области показало присутствие носителей заболеваний BLAD, HH1, HH3, HH4 и BDCMP.
Особей — носительниц патологии синдактилии, цитруллинемии и DUMPS обнаружено не было. Наибольшая доля гетерозиготных особей принадлежит летали HH1 — 7%, доли носительства других мутаций не превышают 4%.
По племенным организациям носительство распределено неравномерно в связи с индивидуальным подходом специалистов хозяйства к подбору быков-производителей при приобретении семени на станциях по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных.
Определены пять быков-производителей — носителей летальных аллелей. Генеалогическим методом продемонстрирована высокая вероятность носительства мутаций для трех из них. Несмотря на выбытие быков-носителей, летальные формы гена могут сохранятся в поголовье за счет гетерозиготных коров.
Об авторах
Оксана Евгеньевна Лиходеевская, кандидат биологических наук, доцент, заведующая лабораторией молекулярных и биологических исследований
lixodeevskaya@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-5976-6030
Георгий Александрович Лиходеевский, младший научный сотрудник
georglihodey@gmail.com https://orcid.org/0000-0003-2616-2166
Полина Сергеевна Богатова, младший научный сотрудник
bogatova.p.s@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-6584-2394
Уральский государственный аграрный университет, ул. Карла Либкнехта, 42, Екатеринбург, 620075, Россия
УДК 636.082.12; 636.234.1
DOI: 10.32634/0869-8155-2025-392-03-62-68
