ДНК-технологии идентификации аллелей и генотипов полиморфных маркеров анализируемого локуса гена iNOS Bos taurus
Индуцибельная синтаза оксида азота — цитоплазматический фермент, кодируемый одноименным геном iNOS (inducible nitric oxide synthase). Указанный фермент способен инициировать как выработку короткоживущих молекул оксида азота, являющихся регулятором системы врожденного иммунитета, так и его реактивных форм — токсичных молекул иммунной системы, подавляющих микробные патогены.
Изучение полиморфизма гена iNOS Bos taurus в ассоциативной связи с чувствительностью и резистентностью к лейкозу крупного рогатого скота, а также его племенной ценностью — актуальная область исследования генетико-селекционной направленности, в долгосрочной перспективе необходимая для воспроизводства высокопродуктивного стада с генетической устойчивостью к указанной хронической инфекционной болезни вирусной природы.
Полимеразная цепная реакция, совмещенная с полиморфизмом длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ), — комбинированный молекулярно-генетический подход к определению генетического полиморфизма, имеющий альтернативное название — расщепленные амплифицированные полиморфные последовательности (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences, CAPS).
Данный комбинированный подход ранее был использован и при разработке способов ПЦР-ПДРФ-генотипирования крупного рогатого скота по полиморфным маркерам, локализованным в анализируемом локусе гена iNOS Bos taurus. При этом из уровня техники известен модифицированный метод Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequences (dCAPS) — полученные расщепленные амплифицированные полиморфные последовательности, приводящий к созданию искусственного сайта рестрикции в анализируемой полиморфной позиции за счет изменения в нуклеотидных последовательностях праймеров.
Среди ДНК-технологий, ориентированных на детекцию Single Nucleotide Polymorphism (SNP) — однонуклеотидный полиморфизм, можно выделить метод прямого секвенирования продуктов ПЦР, позволяющий определить первичную последовательность анализируемого локуса гена.
Таким образом, наряду с применением способов ПЦР-ПДРФ-генотипирования крупного рогатого скота по полиморфным маркерам гена iNOS, с позиции корректной идентификации ряда генотипов SNP-маркеров могут быть востребованы и другие подходы, в том числе основанные на dCAPS и секвенировании.
Цель исследования — разработка ДНК-технологий идентификации аллелей и генотипов SNP-маркеров гена iNOS Bos taurus детекцией и интерпретацией диагностически значимых однонуклеотидных полиморфизмов на основе смоделированных способов проведения вложенной ПЦР с dCAPS-праймерами и SNP-генотипирования анализом данных прямого секвенирования ПЦР-продукта.
Материалы и методы исследования
Работа проведена в лаборатории лейкозоологии Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук в 2024 году.
Конструирование dCAPS-праймеров iNOS-F1 5′-CCTTGGCTTCTTCAGGGCGT-3′ NOS-R1 5′-AAGATCCCCCCTGTCTGGTC-3′ выполнено с применением программного обеспечения OligoAnalyzer 1.2 и dCAPS Finder 2.0 (http://helix.wustl.edu/dcaps/).
Картирование полиморфных сайтов рестрикции у трех SNP-маркеров (AH13-1, AH13-3 и AH13-6) гена iNOS Bos taurus и расчет ПЦР-ПДРФ-профилей возможных генотипов осуществлены с использованием онлайн-программы NEBcutter V2.0 (https://nc2.neb.com/NEBcutter2/).
Экстракция нуклеиновых кислот из 65 отобранных проб цельной консервированной крови голштинизированного скота черно-пестрой породы проведена комплектом реагентов для выделения ДНК из клинического материала «ДНК-сорб B» (ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия).
Постановка ПЦР с праймерами iNOS—F и iNOS—R для амплификации локуса гена iNOS Bos taurus длиной 258 bp выполнена набором реагентов Encyclo Plus PCR kit (ЗАО «Евроген», Россия) согласно ранее использованному протоколу [14]. Постановка гнездовой ПЦР с праймерами iNOS—F1 и iNOS—R1 для амплификации локуса гена iNOS Bos taurus длиной 123 bp выполнена с Taq ДНК-полимеразой со стандартным буфером (ООО «СибЭнзайм, Россия).
Процедура эндонуклеазного расщепления ПЦР-продуктов, амплифицированных со сконструированными праймерами iNOS-F1 и iNOS-R1, осуществлена подобранными для определенного полиморфного маркера рестриктазами. В частности, для детекции полиморфной позиций SNP-маркера AH13-1 10 мкл амплификата смешивали с равным объемом ПДРФ-смеси, содержащей 2 ед. эндонуклеазы рестрикции BstACI в SE-буфере W (ООО «СибЭнзайм», Россия) и инкубировали в термостате при 37 °С в течение 4 часов.
Аналогичный объем амплификата и ПДРФ-смеси, а также схожее время инкубирования использовали и при детекции полиморфных позиций других SNP-маркеров: AH13-3 (5 ед. Bme18I в SE-буфере O (ООО «СибЭнзайм», Россия) и AH13-6 (5 ед. HinfI в SE-буфере O (ООО «СибЭнзайм», Россия).
Далее инкубированные ПЦР-ПДРФ-пробы окрашивали буфером для нанесения образцов ДНК 4X Gel Loading Dye, Blue (ЗАО «Евроген», Россия) и в объеме 20 мкл вносили в лунки 3% агарозного геля, подвергая вместе с маркерами длин ДНК DNA Ladder 50+ bp (ЗАО «Евроген», Россия) горизонтальному электрофорезу в буфере ТBE (pH 8,0) с последующей визуализацией электрофореграмм в УФ-трансиллюминаторе.
Праймеры iNOS-F и iNOS-R, инициирующие амплификацию локуса iNOS-гена Bos taurus длиной 258 bp, использованы и в качестве сиквенсных при расшифровке анализируемых нуклеотидных последовательностей на генетическом анализаторе ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems, США) в лаборатории НПК «Синтол» (Россия) для детекции 6 SNP-маркеров (AH13-1, AH13-2, AH13-3, AH13-4, AH13-5 и AH13-6) методом прямого секвенирования ПЦР-продукта по Сэнгеру.
Результаты и обсуждение
Биоинформационный анализ депонированных в GenBank NCBI нуклеотидных последовательностей локуса гена iNOS Bos taurus (AF465168, LR962749, OX344708), фланкируемых праймерами iNOS—F и iNOS—R, свидетельствует о существовании не менее 6 однонуклеотидных полиморфизмов, рассматриваемых в качестве следующих SNP-маркеров: AH13-1, AH13-2, AH13-3, AH13-4, AH13-5 и AH13-6.
Синтетическая нуклеотидная последовательность анализируемого локуса гена, сформированная в результате множественного выравнивания депонированных в GenBank NCBI последовательностей, представлена на рисунке 1, где смешанные нуклеотиды в полиморфных позициях 6 SNP-маркеров выделены красным цветом.
При этом смешанный нуклеотид Y, локализованный в полиморфной позиции 70 синтетической последовательности локуса гена iNOS, ассоциирован с SNP-маркером AH13-1. Определенные для других SNP-маркеров смешанные нуклеотиды и их полиморфные позиции следующие: AH13-2 (R, 114), AH13-3 (R, 152), AH13-4 (R, 230), AH13-5 (K, 78) и AH13-6 (Y, 82).
На этом же рисунке представлены полиморфные сайты рестрикции трех SNP-маркеров (AH13-1, AH13-3 и AH13-6) и соответствующие ПЦР-ПДРФ-профили их возможных генотипов, сгенерированные при рестрикционном картировании анализируемой последовательности ДНК, ограниченной уже внутренними праймерами iNOS—F1 и iNOS—R1 (рис. 1).
Конструирование dCAPS-праймеров iNOS-F1 и iNOS-R1 продиктовано необходимостью корректной идентификации генотипов SNP-маркеров AH13-1, AH13-3 и AH13-6. При этом введенные в 3′-концевые участки праймеров неспаренные (mismatch) нуклеотиды, выделенные серым цветом (рис. 1), приведут к искусственно созданным полиморфным сайтам рестрикции, затрагивающим SNP-маркеры AH13-1 (BsaHI) и AH13-3 (AvaII). Это в свою очередь позволит обеспечить и корректную идентификацию генотипов AH13-6 ранее отобранной рестриктазой HinfI.
На рисунке 2 представлен результат insilico моделирования ПЦР-ПДРФ-профилей генотипов полиморфных маркеров AH13-1, AH13-3 и AH13-6 гена iNOSBostaurus с эндонуклеазами рестрикции BsaHI, AvaII и HinfI соответственно.
Генерация рассчитанных ПЦР-ПДРФ-фрагментов и ассоциированных с ними профилей генотипов опосредована полиморфной позицией: SNP-маркера AH13-1 в положении 70, приводящей с dCAPS-праймером iNOS—F1 к созданию участка узнавания рестриктазы BsaHI (GR/CGYC) при SNP с заменой тимина (T) на цитозин (C); SNP-маркера AH13-3 в положении 152, приводящей с dCAPS-праймером iNOS—R1 к созданию участка узнавания рестриктазы AvaII (G/GWCC) при SNP с заменой аденина (A) на гуанин (G); SNP-маркера AH13-6 в положении 82, приводящей к созданию участка узнавания рестриктазы HinfI (G/ANTC) при SNP с заменой цитозина (C) на тимин (T) (рис. 1, 2).
В настоящем исследовании сконструированные dCAPS-праймеры iNOS-F1 и iNOS-R1, инициирующие амплификацию локуса гена iNOS Bos taurus длиной 123 bp, были применены в статусе внутренних пар олигонуклеотидов при постановке вложенной ПЦР (2-й раунд) с использованием в качестве пробы ДНК 2 мкл амплификата 1-го раунда ПЦР, предварительно наработанного с праймерами iNOS—F и iNOS—R.
При этом праймеры iNOS—F и iNOS—R, инициирующие амплификацию локуса гена iNOS Bos taurus длиной 258 bp, были использованы не только в статусе внешних пар олигонуклеотидов, но и в качестве сиквенсных при расшифровке анализируемых нуклеотидных последовательностей для детекции 6 SNP-маркеров методом прямого секвенирования ПЦР-продукта.
Наглядные фрагменты аналитической картины результата секвенирования амплифицированного локуса гена iNOS Bos taurus представлены на рисунке 3.
На нем в качестве примера идентификационного потенциала SNP-генотипирования анализом данных прямого секвенирования ПЦР-продукта локуса гена iNOS Bos taurus проведены детекция и интерпретация диагностически значимых однонуклеотидных полиморфизмов в контексте идентификации аллелей и генотипов 6 SNP-маркеров: AH13-1 (генотип CT), AH13-2 (генотип GG), AH13-3 (генотип AG), AH13-4 (генотип AA), AH13-5 (генотип TT) и AH13-6 (генотип CT).
Наглядные же примеры полученных электрофореграмм ПЦР-ПДРФ-профилей генотипов SNP-маркеров AH13-1, AH13-3 и AH13-6 гена iNOS Bos taurus, сгенерированныхс внутренними праймерами и отобранными рестриктазами, представлены на объединенном рисунке 4.
На нем в общей сложности запечатлены ПЦР-ПДРФ-профили трех генотипов SNP-маркеров AH13-1 (TT, CC, CT) и AH13-3 (AA, GG, AG), а также двух генотипов AH13-6 (CC иCT). При этом генотип TT SNP-маркера AH13-6 в ходе тестирования предложенного способа генотипирования в исследуемой выборке крупного рогатого скота не выявлен.
Следует отметить, что дополнительно отобранные эндонуклеазы рестрикции (BsaHI и AvaII) были успешно заменены на их прототипы, в частности BsaHI на изошизомер BstACI, а AvaII на изошизомер Bme18I. Данные изошизомеры и рестриктаза HinfI доступны к приобретению на территории Российской Федерации благодаря их производству и реализации отечественной компанией ООО «СибЭнзайм».
Выводы
Сконструированные dCAPS-праймеры iNOS-F1 иiNOS—R1, предназначенные для корректной идентификации генотипов SNP-маркеров AH13-1, AH13-3, AH13-6, успешно протестированы при постановке вложенной ПЦР в статусе внутренних пар олигонуклеотидов с последующей процедурой эндонуклеазного расщепления амплифицированного локуса гена iNOS Bos taurus длиной 123 bp подобранными рестриктазами, диагностически значимыми для определенного полиморфного маркера. Амплификат 1-го раунда ПЦР длиной 258 bp, предварительно наработанный с праймерами iNOS—F иiNOS—R в статусе внешних пар олигонуклеотидов, был подвергнут секвенированию ДНК для детекции и интерпретации диагностически значимых однонуклеотидных полиморфизмов в контексте идентификации аллелей и генотипов 6 SNP-маркеров: AH13-1, AH13-2, AH13-3, AH13-4, AH13-5 и AH13-6.
Использованные в работе ДНК-технологии являются действенными подходами к корректному генотипированию крупного рогатого скота по SNP-маркерам гена iNOS.
Об авторах
Рамиль Ришадович Вафин, доктор биологических наук, профессор РАН, научный консультант
vafin-ramil@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-0914-0053
Хамид Халимович Гильманов, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
gilmanov.xx@mail.ru https://orcid.org/0000-0001-7053-6925
Федеральный научный центр — Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко РАН, Рязанский пр-т, 24, Москва, 109428, Россия
УДК: 577.2.0:636.082.2
DOI: 10.32634/0869-8155-2025-394-05-89-94
