Динамика экстракции минералов из кормового субстрата in vitro при внесении в реакционную среду рубцового содержимого низкомолекулярных добавок
Масштабная проблема антибиотикорезистентности и вводимые в виду этого запреты на применение бактерицидных препаратов в терапевтических целях или как стимуляторов роста в животноводческом секторе побуждают к активному поиску высокоэффективных альтернатив. Среди последних выделяют нано- и ультрадисперсные частицы, антимикробные пептиды, органические кислоты, про- и пребиотики. Подобные вещества, как правило, либо селективно подавляют рост и развитие патогенной микрофлоры, либо способствуют активному размножению бактерий с нутрициологически полезными свойствами, среди которых целлюлозолитические, амилолитические, молочнокислые, Pseudobutyrivibrio, Lachnospira, Anaerovibrio и др.
При этом, однако, всё большее внимание уделяется биологически активным веществам растительного происхождения — фитобиотикам. В частности, из-за того факта, что различные представители царства флоры с древнейших времен используются в этнофармакологии не только как противомикробные, но и как гепатопротекторные, антиоксидантные, антистрессовые, микрофлоромодулирующие и иммуностимулирующие средства. Они же, как правило, выступают и в качестве источника для открытия новых лекарственных препаратов. К примеру, аспирин впервые был получен из салицина, выделенного из коры дерева Salix alba L., алкалоид морфин, необходимый для синтеза болеутоляющего средства кодеина, — из опийного мака (Papaver somniferum), дигитоксин, кардиотонический гликозид, — из наперстянки (Digitalis pupurea L.), хинин, используемый для лечения малярии, лихорадки, несварения желудка, заболеваний полости рта и горла, — из коры Cinchona succirubra Pav.,пилокарпин (препарат для лечения глаукомы) — из Pilocarpus jaborandi (Rutaceace).
Таким образом, фитобиотики сегодня представлены не только в форме экстрактов, перемолотого ботанического сырья, эфирных масел и живиц, но и в качестве очищенных молекулярных субстратов, содержащих алкалоиды, аминокислоты, витамины, гликозиды, горечи, танины, жирные масла, камеди, лактоны, фенольные кислоты, пектины, сапонины, смолы, терпены и терпеноиды, фитонциды, флавоноиды, антрахиноны и стероиды. Все это по сути своей — вторичные метаболиты, синтезируемые растениями для защиты от вредоносных бактерий, простейших, насекомых, грибков и даже неблагоприятных погодных условий. Иными словами, это весьма вариабельные, как по составу, так и по свойствам, вещества, что одновременно открывает фактически неограниченное поле для научных поисков и тем не менее накладывает определенный лимит на масштабное применение фитобиотиков в практике кормления, поскольку перед введением в рацион любой из возможных комбинаций необходимо проводить масштабную и комплексную оценку их эффектов in vitro и in vivo не только на продуктивность, но и на различные аспекты метаболического и физиологического статуса животных.
Цель работы — выявление динамики элементного профиля рубцовой жидкости крупного рогатого скота при включении в реакционную среду invitro низкомолекулярных добавок на основе кверцетина дигидрата, 7-гидроксикумарина, ванилина и транскоричного альдегида, что позволит судить о степени экстракции минералов из корма в процессе пищеварения как компонентов акцессорных веществ, необходимых для функционирования ферментов, витаминов, гормонов и так далее, а также проследить степень инклюзии в биохимические процессы некоторых токсичных или условно токсичных элементов.
Материалы и методы исследования
Исследование проводилось на базе Центра коллективного пользования ФГБНУ «Федеральный научный центр биологических систем и агротехнологий РАН» (г. Оренбург).
Манипуляции с животными и экспериментальные исследования с целью сведения к минимуму страданий были выполнены в соответствии с инструкциями и рекомендациями нормативных актов: модельного закона Межпарламентской ассамблеи государств — участников Содружества Независимых Государств «Об обращении с животными», ст. 20 (Постановление МА государств — участников СНГ от 31.10.2007 № 29-17); протокола Женевской конвенции International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals; ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики».
Протокол настоящего исследования одобрен Комитетом по биоэтике ФГБНУ ФНЦ БСТ РАН (протокол от 05.03.2021 № 1).
В серии из шести идентичных экспериментов оценивали влияние химически активных низкомолекулярных соединений на пищеварительный процесс в искусственном рубце (ANKOM Daisy II, США). Рубцовую жидкость для опыта отбирали у бычков казахской белоголовой породы средней массой 266 ± 1,53 кг и возрастом 11–12 месяцев через хроническую фистулу (d = 80 мм, ANKOM Technology Corporation, США). Транспортировку осуществляли в течение 30 мин., поддерживая температурный режим +38,5–39,5 °С. Перед использованием рубцовую жидкость тщательно встряхивали и процеживали через четыре слоя марли. Заранее мешочки из полиамидной ткани (n = 10) взвешивали и нумеровали, в них помещали по 500 мг пшеничных отрубей (базовый субстрат) и запаивали. Рубцовую жидкость, разведенную буфером в соотношении 1:4, насыщали углекислым газом и по 2 л размещали в емкостях искусственного рубца, задавая программу (48 ч. при +39,5 °С). При этом в каждом эксперименте в реакционную среду в качестве объектов исследования вносили следующие вещества (или их комбинации):
1) Ванилин (CAS: 121-33-5, 99%; Acros Organics, США) — фенольный альдегид с молекулярной формулой C8H8O3, в структуре которого присутствуют гидроксильная и эфирная функциональные группы, прикрепленные к ароматическому кольцу. Молярная масса — 152,15 г/моль. Это основной компонент экстракта стручков орхидеи Vanilla planifolia с выраженными противоопухолевыми, нейропротекторными, антибиотическими и антикворумными характеристиками.
2) Кверцетин дигидрат (CAS: 6151-25-3, 95+%; Acros Organics, США) с молекулярной формулой C15H10O7 × 2H2O — входит в группу флавоноидов и представляет собой агликон без углеводной группы, что обусловливает его способность образовывать с сахарами различные гликозиды. Молярная масса — 338,30 г/моль. Встречается в экстрактах и эфирных маслах многих растений. Обладает антиоксидантной, антибактериальной и противопаразитарной активностью вкупе с вазопротекторными и антииммуносупрессионными свойствами. Демонстрирует способность смягчать действие микотоксинов.
3) Транскоричный альдегид, или циннамаль (3-фенил-2-пропеналь в виде трансизомера; CAS: 104-55-2, 99%; Acros Organics, США) — основной компонент эфирного масла Cinnamomum sp., монотерпеновый углеводород C9H8O. Благодаря наличию альдегидной группы с сопряжением по двойной связи в концевой цепи проявляет свойства ненасыщенных альдегидов. Молярная масса — 132,16 г/моль. Применяется в народной медицине как антиоксидантное, противовоспалительное и антибактериальное средство при лечении диабета, заболеваний сердечно-сосудистой, дыхательной и пищеварительной системы, синдромов Паркинсона и Альцгеймера.
4) 7-гидроксикумарин (CAS: 93-35-6; Acros Organics, США) — лактон о-оксикоричной кислоты, гетероциклическое соединение из класса бензопиренов состава C9H6O3, получаемое из бобов тонка — семян Dipteryx odorata. В нативном виде представляет собой бесцветные кристаллы, при растворении в воде проявляет слабокислые свойства благодаря наличию связанной с конденсированной системой гидроксогруппы. Молярная масса — 162,14 г/моль. Кумарины и их производные обладают широким спектром биологически активных свойств, в частности антикоагулянтными, бактерицидными, противовоспалительными, антиоксидантными, противовирусными и фермент-ингибирующими.
Дозировки опытных веществ (табл. 1) были установлены с помощью теста ингибирования люминесценции и системы Quorum Sensing у бактерий в предшествующих работах.
Пробоподготовку осуществляли по следующей методике. Рубцовую жидкость по завершении инкубации с базовым субстратом (пшеничными отрубями) и исследуемыми веществами тщательно перемешивали, брали объем (0,5 мл), взвешивали с точностью до 0,0001 г во фторопластовой виале, выдерживающей высокое давление и температуру. Добавляли 4 мл концентрированной азотной кислоты (ОСЧ). Виалу герметично закрывали и помещали в микроволновую систему пробоподготовки TOPEX+ (PreeKem, Китай). Здесь пробы подвергались термоокислительной деструкции под воздействием сверхвысокочастотного излучения, что приводило к разрушению неорганической и органической матриц, препятствующих проведению элементного анализа. Получившийся раствор переливали в мерную пробирку на 10 мл, смывали остатки со стенок виалы и доводили объем высокочистой водой. Из полученного раствора отбирали 1 мл, снова разбавляли в 10 раз высокочистой водой. Таким образом получали готовую пробу, идущую на анализ.
Стандартные растворы готовили из мультиэлементной смеси (Merck, Германия) с добавлением вручную приготовленного стандарта макроэлементов (K, Na, Mg, Ca). Разводили стандартные растворы 2,6%-ным раствором азотной кислоты (ОСЧ).
Элементный анализ проводили на одноквадрупольном масс-спектрометре с индуктивно связанной плазмой Agilent 7900 ICP-MS (Agilent, США). Анализ таких элементов, как Cr, Fe и Zn, осуществляли в гелиевом режиме с использованием столкновительной ячейки. Метод основан на разрушении пробы в условиях высокотемпературной аргоновой плазмы (в кварцевой горелке, генератор плазмы — радиочастотный излучатель на 27 МГц) и детектировании отдельных изотопов в виде отношения их массы к заряду. Концентрацию искомых элементов выражали в мг элемента на 1 кг пробы с учетом суммы инструментальной (± 5%) и методической (± 3%) ошибок.
Статистическую обработку полученных данных проводили c использованием Statistica 10.0 (StatSoft Inc., США) и программного обеспечения Microsoft Office. Достоверность различий сравниваемых показателей определяли по t-критерию Стьюдента. Достоверными считали значения при р ≤ 0,05, р ≤ 0,01, р ≤ 0,001.
Результаты и обсуждение
Рубцовый микробиом жвачных животных, как известно, представляет собой сложнейшую высокодифференцированную и внутреннесвязанную экосистему из бактерий, простейших и грибков, каждый представитель которой вносит тот или иной вклад в общую динамику метаболических и биохимических процессов, участвует в деструкции и трансформации высокомолекулярных соединений в низкомолекулярные, опосредует целлюлозолитический, амилолитический, протеолитический и липолитический потенциал. Соответственно этому, то есть степени расщепления органической матрицы, меняется и динамика экстракции минералов из корма, однако здесь следует учесть и другие параметры, такие как потребность отдельных видов прокариот и простейших в определенных эссенциальных элементах, а также антагонистические и синергетические взаимоотношения между последними. Так, в первом опыте использование ванилина в концентрации 1,225 × 10-4 моль/л вело к снижению уровня Cu на 52% (р ≤ 0,01), Mg на 30% (р ≤ 0,01), Co на 36% (р ≤ 0,05), K на 21% (р ≤ 0,01) относительно контроля (табл. 2).
При этом концентрации Fe, Ni, Mn, Ba и Al выросли на 58% (р ≤ 0,01), 72% (р ≤ 0,01), 22% (р ≤ 0,01), 22% (р ≤ 0,05) и 132% (р ≤ 0,001) соответственно (рис. 1).
Такая динамика может быть обусловлена несколькими причинами. Во-первых, ранее было показано, что ванилин ингибирует рост популяции простейших, при этом, однако, стимулируя размножение Ruminococcus flavefaciens, Prevotella bryantii, Butyrivibrio fibrisolvens, Prevotella ruminicola, Clostridium aminophilum и Ruminobacter amylophilus. Они же в свою очередь активно разлагают клетчатку, сбраживают сахара и расщепляют пептиды, вследствие чего из кормового субстрата высвобождается спектр макро- и микроэлементов (в частности, железо и алюминий выходят из гемицеллюлозных и пектиновых комплексов). Во-вторых, возможно образование нерастворимых агрегатов с антагонистами внутри растительных волокон. Так, например, известно, что сера и молибден формируют с медью прочный тиомолибдатный осадок. Более того, соединения алюминия влияют на растворимость в рубце цинка и других бивалентных катионов. Соответственно, подобное распределение не следует считать оптимально выгодным, так как недостаток Cu, Mg, Co и K может негативно сказаться на функциональном состоянии микробиоты рубца и организма-хозяина. В частности, медь входит в состав (или является кофактором) таких ферментов, как цитохром-с-оксидаза, тирозиназа, аминоксидаза, супероксиддисмутаза Cu/Zn, и некоторых других, она участвует в производстве энергии и процессах биосинтеза, выполняет роль динамической сигнальной молекулы, ингибирует липолиз, регулирует работу калиевых каналов и активность E3-убиквитинлигазы.
Магний, как второй после калия внутриклеточный катион в составе ферментативных субстратов, например АТФ-Mg и ГТФ-Mg, или через прямую активацию опосредует функционирование ДНК- и РНК-полимераз, эндо- и экзонуклеаз, топоизомеразы, хеликазы, лигазы, протеинкиназы, аденилат- и гуанилатциклаз, Na/K- и Ca2+-АТФаз, креатинкиназы, гексокиназы, фосфофруктокиназы, альдолазы, фосфоглицераткиназы и пируваткиназы. Иными словами, он участвует в процессах репликации и репарации, транскрипции и трансляции, выступает ключевым фактором поддержания геномной и генетической стабильности, опосредует некоторые реакции гликолиза, влияя тем самым на доступность глюкозы в клетке. Магний же фигурирует в процессах клеточной адгезии, трансмембранном переносе электронов, как антагонист кальция — в сокращении и расслаблении мышц, высвобождении нейромедиаторов, выполняет структурную функцию в белках, полирибосомах, нуклеиновых кислотах и митохондриях.
Калий наряду с натрием регулирует водный и кислотно-щелочной баланс в организме, играет важную роль в передаче электрических импульсов в сердце, поддерживая мембранный потенциал, определяет функционал возбудимых тканей — нервной и мышечной.
Кобальт входит в состав коррина — модифицированного тетрапирольного кольца витамина B12, природные формы которого — 1,5-дезоксиаденозилкобаламин, гидроксикобаламин, метилкобаламин и аденозилкобаламин — синтезируются бактериями и археями из родов Bacillus, Escherichia, Fervidobacterium, Kosmotoga, Lactobacillus, Mesotoga, Nitrosopumilus, Petrotoga, Propionibacterium, Proteobacteria, Pseudomonas, Rhodobacter, Rhizobium, Salmonella, Sinorhizobium, Thermosipho и Thermotoga. При этом кобаламин необходим им для липидного и углеводного обмена, синтеза ДНК, а также для функционирования диолдегидратазы, этаноламинаммон-лиазы, глутамат- и метилмалонил-КоА-мутазы, метионинсинтазы и рибонуклеотидредуктазы, катализирующих ряд реакций трансметилирования и перегруппировки. Однако только 3–13% кобальта рациона включаются в метаболизм жвачных бактериями рубца. Соответственно, снижение доли экстракции перечисленных элементов может негативно сказаться на общефизиологическом состоянии и продуктивности животных. Более того, значительное увеличение концентрации алюминия и бария в рубцовой жидкости потенциально может подавлять рост микрофлоры, упрощая метаболическую цепочку и снижая переваримость кормовых ингредиентов.
Аналогично применение ванилина в дозировке 2,450 × 10-4 моль/л сопровождалось еще большим снижением уровня Cu — на 67% (р ≤ 0,01), увеличением концентрации Cа на 37% (р ≤ 0,01), Sr — на 26% (р ≤ 0,05), Ba — на 14% (р ≤ 0,05). Наблюдалась выраженная тенденция по увеличению уровня цинка (+ 23%). Сохранялась динамика в отношении Co, Mn, Fe и Al (рис. 2).
Внесение ванилина в реактор в количестве 4,900 × 10-4 моль/л дополнительно вело к снижению концентрации Pb — на 38% (р ≤ 0,001), Zn — на 35% (р ≤ 0,01), Bi — на 18% (р ≤ 0,05). Резко увеличивались: Cr — на 61% (р ≤ 0,05), Mn — на 110% (р ≤ 0,001) (рис. 3).
И хотя нивелирование доли свинца и висмута как токсичных элементов, индуцирующих окислительный стресс путем повышения продукции активных форм кислорода (АФК) в митохондриальной цепи переноса электронов, выступает как положительный аспект, всё еще сохраняются негативные тенденции по отношению к меди. При этой же дозировке, в отличие от предыдущих, достоверно снижается экстракция цинка, а он, как известно, необходим для формирования вторичной структуры почти 10% белков, закодированных в геноме млекопитающих (некоторые факторы транскрипции, внутриклеточные рецепторы гормонов, металлотионеины и многие энзимы). В составе ферментов (или как их кофактор) цинк участвует в метаболизме белков, углеводов, липидов и нуклеиновых кислот (карбоангидразы, щелочной фосфатазы, ферментов цикла мочевины), клеточной сигнализации, экспрессии генов (белка p53 и других белков репарации ДНК), мембранном транспорте, модуляции окислительно-восстановительного потенциала (Cu/Zn-супероксиддисмутазы, каталазы и пероксидазы) и клеточном дыхании.
Важно отметить, что введение в реакционную среду ванилина во всех концентрациях или дозозависимо способствовало улучшению экстракции Mn, Fe, Ca и Cr, что может быть полезным при коррекции соответствующих гипоэлементозов.
Марганец участвует в синтезе и активации многих оксидоредуктаз, трансфераз, гидролаз, лиаз, изомераз и лигаз, метаболизме глюкозы и липидов, катализе синтеза белков, витаминов С и группы В, кроветворении, регуляции эндокринной системы и иммунной функции. Кроме того, металлоферменты Mn, включая аргиназу, глутаминсинтетазу, фосфоенолпируватдекарбоксилазу и Mn-супероксиддисмутазу, также участвуя в перечисленных выше процессах, снижают окислительный стресс против свободных радикалов. Марганец особо необходим для нормального роста и развития бактерий из родов Lactiplantibacillus и Lacticaseibacillus, способствующих лучшему усвоению сухого вещества корма в рубце жвачных животных. Присутствие марганца положительно сказывается на бактериальной популяции, участвующей в переваривании клетчатки. Дефицит марганца в рационе ведет к возникновению костных и неврологических дефектов, нарушению фертильности и сахарному диабету.
Железо, недостаток которого сопровождается возникновением анемии, в организме млекопитающих большей частью представлено в виде гемопротеинов (гемоглобина или миоглобина, гемовых ферментов) или негемовых соединений (флавин-железных ферментов, трансферных ферментов, ферритина). Организм нуждается в железе для синтеза транспортных белков и гема, а также железосодержащих ферментов, участвующих в переносе электронов и окислительно-восстановительных процессах. Важнейшие ферменты в метаболизме ДНК, включая различные геликазы, нуклеазы, гликозилазы, деметилазы и рибонуклеотидредуктазу, используют железо в качестве незаменимого кофактора для функционирования. Недавние результаты показали, что каталитическая субъединица ДНК-полимераз содержит консервативные цистеин-богатые мотивы, которые связывают кластеры «железо — сера» (Fe/S), необходимые для образования стабильных и активных комплексов.
Кальций не только является самым распространенным минералом в организме животных, слагая основу костной ткани, но и участвует во многих физиологических процессах: свертывании крови, сокращении мышц, передаче межклеточных сигналов, возбудимости и проницаемости цитоплазматических мембран, экзокринной секреции, нейротрансмиссии, стабилизации и активации ферментов. Ионизированный кальций участвует в активации протеинкиназ, фосфорилировании ферментов и как посредник клеточного ответа на такие гормоны, как адреналин, глюкагон, вазопрессин, секретин и холецистокинин. На уровне бактериома наряду с другими двухвалентными катионами Ca2+ явно играет структурную роль в формировании клеточной стенки, регуляции синтеза липидов и процессе репликации ДНК.
Хром участвует в регуляции углеводного и липидного обмена, способствует превращению избыточного количества сахаров в жиры, стимулирует синтез жирных кислот и холестерина из ацетата в печени, входит в состав низкомолекулярного органического комплекса — фактора толерантности к глюкозе, вместе с инсулином действует как регулятор уровня сахара в крови, способствует структурной целостности молекул нуклеиновых кислот, регулирует работу сердечной мышцы и функционирование кровеносных сосудов, способствует выведению из организма токсинов, солей тяжелых металлов, радионуклидов. Дефицит хрома сопряжен с непереносимостью глюкозы и инсулинорезистентностью.
Интересно, что при минимальных концентрациях ванилина возрастала экстракция никеля, однако этот эффект был тем меньше, чем выше были дозировки. Хотя никель и не выполняет определенных функций в организме млекопитающих, он необходим многим бактериям, археям и простейшим эукариотам как кофактор ряда ферментов — [NiFe]-гидрогеназы, [NiFe]-дегидрогеназы окиси углерода, ацетил-КоА-декарбонилазы/синтазы, метил-КоМ-редуктазы, уреазы, Ni-супероксиддисмутазы, лактатрацемазы, глиоксилазы I и ациредуктондиоксигеназы, катализирующих, соответственно, окисление молекулярного водорода до протонов и электронов, окисление CO в CO2, синтез ацетил-КоА, восстановление метил-S-коэнзима М (CH3-S-CoM) с образованием метана, гидролиз мочевины с образованием аммиака и карбамата (саморазлагается на аммиак и угольную кислоту), дисмутацию супероксидных анионов в перекись водорода и кислород, взаимопревращение между изомерами l- и d-молочной кислоты, преобразование гемитиоацеталя в S-d-лактоилглутатион, переход ациредуктона в формиат, монооксид углерода и метилтиобутировую кислоту.
Таким образом, в ходе первого опыта было показано, что ванилин наиболее способствует экстракции из кормового субстрата марганца, железа, кальция и алюминия, напротив, подавляя извлечение меди, кобальта и свинца. Во втором эксперименте использование кверцетина в концентрации 2,450 × 10-4 моль/л вело к снижению содержания большинства анализируемых элементов (рис. 4), максимальному в отношении Zn (-60%, р ≤ 0,01). Уровень токсичного для микробиоты Pb упал на 51% (р ≤ 0,01). Содержание Al и Bi в пробах достоверно увеличилось на 34% (р ≤ 0,01) и 95% (р ≤ 0,01) соответственно.
Распределение элементов в рубцовой жидкости при дозировке кверцетина 4,900 × 10-4 моль/л выглядит более выгодным для процесса пищеварения (рис. 5): уменьшаются относительно первого случая потери макро- и микроэлементов. В то же время концентрация Fe повышается на 19% (р ≤ 0,05), что может способствовать размножению некоторых видов бактерий, в том числе бутиратпродуцирующих Selenomonas ruminantium.
Эффектов от дальнейшего увеличения концентрации кверцетина (9,800 × 10-4 моль/л) не выявлено — элементные сдвиги аналогичны таковым при минимальной дозе (рис. 6).
Подобная динамика может быть обусловлена более выраженным в сравнении с ожидаемым бактерицидным эффектом кверцетина, что проявляется в повреждении клеточной мембраны или нарушении ее проницаемости, угнетении синтеза нуклеиновых кислот (ингибировании ДНК-гиразы прокариот) и белков, митохондриальной дисфункции или в предотвращении образования биопленки. Последнее может возникнуть в случае различных изменений химической структуры молекулы в реакционной среде рубцового содержимого либо же при быстром разложении кверцетина микробиотой на 3,4-дигидроксифенилуксусную кислоту и 4-метилкатехол.
Похожие данные были получены и в третьем эксперименте (коричный альдегид). Только концентрация 3,050 × 10-5 моль/л (рис. 7b) способствовала повышению уровней экстракции Mn, Na и Cr на 14% (р ≤ 0,05), 16% (р ≤ 0,05) и 115% (р ≤ 0,01) соответственно. Во всех трех дозировках коричного альдегида наблюдалось одинаковое, достоверное и существенное снижение содержания Cu (81%, р ≤ 0,001). Коричный альдегид (подобно кверцетину) повреждает поверхностные структуры клеток прокариот и ингибирует кворум-сенсинг, но, кроме того, изменяет липидный профиль, подавляет активность АТФазы, деление клеток и мембранные порины. Помимо прочего, как было показано с помощью количественного протеомного анализа на примере грибка P. Expansum, коричный альдегид подавлял большую часть из 146 выявленных дифференциально экспрессируемых белков, участвующих в метаболизме углеводов, а также активность 6 ключевых регуляторных ферментов гидролизации целлюлозы, цикла Кребса, гликолиза и пентозофосфатного пути, что может существенно сказаться на высвобождении минеральных элементов из целлюлозной матрицы растительных клеток.
Транскоричный альдегид ингибировал карбоксилтрансферазный компонент ацетил-КоА карбоксилазы Escherichia coli, но не влиял на активность компонента биотинкарбоксилазы. Паттерны ингибирования указывали на то, что эти продукты связываются с сайтом связывания биотина карбоксилтрансферазы с транскоричным альдегидом. Отметим, что здесь во всех дозировках снижалась степень экстракции эссенциальных Co, Cu и Zn, а также токсичных Pb и Sr.
В четвертом эксперименте (кумарин) наиболее выгодным для микробиоты рубца следует считать элементный профиль при концентрации действующего вещества в 2,450 × 10-4 моль/л (рис. 8b).
В этом случае повышение уровня Mg на 14% (р ≤ 0,05) дает дополнительный базис питания для многих простейших и грибков рубцовой жидкости, в частности для Anaeromyces mucronatus, Neocallimastix spp., Piromyces spp., Orpinomyces spp. и Caecomyces spp., которые участвуют в процессах расщепления целлюлозы. При этом, однако, была значительно выражена тенденция по накоплению в рубцовой жидкости висмута, что при условии метаболизации микробиотой в летучие соединения может нанести определенный вред экосистеме рубца из-за повышенной токсической нагрузки. Кумарин подвергается постепенной деградации, как и вышеописанные соединения.
В пятом эксперименте формирование различных комбинаций малых молекул вело к ожидаемо дифференцируемым результатам (рис. 9). Так комплексы коричного альдегида с кверцетином и кумарином способствовали максимальному нивелированию степени экскреции минералов из базового субстрата относительно контроля. Напротив, сочетание кверцетина с ванилином или кумарином стимулировало этот процесс. Такой эффект можно объяснить исходя из взаимодополняющих свойств фитобиотиков, однако для полной уверенности в возможности синергетических функций необходим детальный анализ биохимических превращений исследуемых веществ в рубце жвачных.
Наконец, в шестом эксперименте (рис. 10) при комбинации четырех веществ наблюдалось достоверное увеличение концентрации многих макро- и микроэлементов — K (+113%, р ≤ 0,01), Na (+90%, р ≤ 0,001), Co (+50%, р ≤ 0,01), Cr (+42%, р ≤ 0,01), Ca (+28%, р ≤ 0,01) Ni (+27%, р ≤ 0,05), но также и некоторых токсичных — Pb (+29%, р ≤ 0,01), Sr (+29%, р ≤ 0,01), Ba (+50%, р ≤ 0,01). Уменьшались уровни алюминия (-38%, р ≤ 0,01), кадмия (-43%, р ≤ 0,05), цинка (-28%, р ≤ 0,01), меди (-18%, р ≤ 0,05).
Таким образом, среди представленных комбинаций наибольшим стимулирующим эффектом в отношении увеличения степени экстракции минеральных составляющих из корма является добавка кверцетин + ванилин, что в свою очередь дает возможность рекомендовать ее к использованию в составе рациона жвачных животных. Этот же факт косвенно позволяет судить об интенсификации пищеварительных процессов.
Выводы
Фитобиотические добавки, в том числе малые молекулы растительного происхождения, демонстрируют существенный потенциал в области управления биохимическими и микробиологическими процессами в рубце жвачных, в том числе влияют на элементный профиль его содержимого, то есть на степень экстракции минералов из кормового субстрата. Показано, что ванилин в концентрации от 1,225 × 10-4 до 4,900 × 10-4 моль/л снижает накопление меди, кобальта и свинца, стимулируя извлечение марганца, железа, алюминия и бария. Кверцетин и коричный альдегид, напротив, подавляют экстракцию почти всех исследованных элементов. Кумарин же в большей степени способствует извлечению минералов из целлюлозной матрицы растительных компонентов корма, за исключением меди, кобальта и цинка. При этом лучший эффект обнаруживает комбинация кверцетина и ванилина — в концентрациях 2,450 × 10-4 и 1,225 × 10-4 моль/л соответственно. Такой комплекс, судя по всему, позволяет значительно разнообразить микрофлору рубцовой жидкости и способствовать перераспределению элементного профиля в пользу более активной биохимической трансформации компонентов поступающей пищи. Проведенное исследование демонстрирует, что фитобиотики и их комплексы потенциально могут быть использованы при коррекции гипо- и гиперэлементозов различной направленности у жвачных. Однако для более глубокого анализа механизмов интенсификации экстракции макро- и микроэлементов необходимо проведение детального анализа качественного и количественного состава микробиоты методом in vitro или in situ.
Выводы
Ксения Николаевна Атландерова, кандидат биологических наук, научный сотрудник
atlander-kn@mail.ru http://orcid.org/0000-0003-3977-4831
Даниил Евгеньевич Шошин, младший научный сотрудник
daniilshoshin@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-3086-681Х
Кирилл Александрович Казаев, младший научный сотрудник
kazaevk970@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-0443-6990
Федеральный научный центр биологических систем и агротехнологий,
ул. 9 Января, 29, Оренбург, 460000, Россия
УДК 57.044: +636.2
DOI: 10.32634/0869-8155-2025-392-03-47-61
Просмотров: 274
