Перспективы применения современных методов окрашивания ядрышкообразующих областей для диагностики заболеваний у животных
Ядрышко — важный клеточный компонент, участвующий в биогенезе рибосом. В ядрышке транскрибируются 47S рибосомные РНК (рРНК), расщепляются и собираются с 80 рибосомными белками и 5S РНК с образованием субъединиц 40S и 60S рибосом. Ядрышки состоят из ядрышкообразующих областей (ЯОР или NOR), которые являются активными частями хромосом в ядре и локализуются в области вторичных перетяжек хромосом. Существуют различия в количестве и локализации ЯОР в геномах. У человека они представляют собой петли ДНК, содержащие рибосомные гены (рДНК) и расположенные на коротких плечах пяти пар акроцентрических хромосом (хромосомы 13, 14, 15, 21 и 22). В геномах млекопитающих ЯОР расположены на аутосомах, достаточно часто на коротких плечах акроцентрических хромосом и реже теломерных, перицентромерных или интерстициальных областях и состоят из тандемно повторяющихся последовательностей генов рДНК, кодирующей 18S, 5.8S и 28S рРНК.
Ядрышки представляют собой контрастные гранулы, визуализирующиеся в ядрах клеток и наблюдаемые при использовании фазово-контрастной микроскопии. Количество хромосом, несущих ЯОР, варьирует в зависимости от вида и стадии митоза (в конце митоза, поздней стадии телофазы), каждая часть активной области отвечает за образование одного или нескольких ядрышек в зависимости от вида животных. У млекопитающих их количество в клетках колеблется от 1 до 6 и более со значительной вариабельностью их размеров. Определить точное количество ядрышек невозможно. Например, у человека ядрышки сливаются через 1-2 ч после вступления клеток в интерфазу и другие межфазные периоды. Они различаются по форме и размеру в зависимости от типа клеток и даже в пределах одной клетки. В клетках человека размер варьирует от менее 0,5 мкм у зрелых лимфоцитов до 3-9 мкм у пролиферирующих и раковых клеток.
Обсуждение
Свойства пролиферативной активности ЯОР. Ядрышки являются своеобразными ориентирами цитологических исследований и являются структурными компонентами клеточного ядра. К важнейшим свойствам ядрышка относится индикация общего уровня метаболизма клеток и способность их к пролиферации. В исследованиях M. Hork с другими учеными (2002) и R. Stuart-Harris R. с коллегами (2008) было выявлено, что в активно пролиферирующих клетках ядрышки обладают более крупными размерами, а также что их размер связан со скоростью пролиферации. Методы выявления патологических процессов, происходящих на протяжении всего клеточного цикла в организме и основываются на изменении количественного содержания их белков. Активность зон ЯОР связана с определением морфофункционального состояния клеток крови. Именно, поэтому, лабильность морфологических показателей ядрышка (число, форма, размер) считают основной функциональной особенностью.
Одним из свойств использования метода ЯОР при дифференциации злокачественных и доброкачественных онкозаболеваний по сравнению с дорогостоящими методами является то, что для определения площади и размера ядрышек он является достаточно дешевой альтернативой методов, используемых при микроскопии и цитометрии.
Методы визуализации ЯОР. ЯОР представляют собой хромосомные петли ДНК, участвующие в рибосомном синтезе и некоторые белки, связанные с ними, окрашиваются серебром. Именно поэтому, для визуализации ядрышек стали использовать метод коллоидного серебра (методика M.Howell и D.A.Black, 1980). В качестве стабилизатора и катализатора реакции используется желатин.
В настоящее время разработано несколько модификаций этого метода с целью исследования различных клеток и тканей организма. Как уже было сказано выше, нитрат серебра окрашивает активно функционирующие ЯОР и, именно, это свойство позволяет параллельно оценить возможность функционального состояния рибосомных генов в клетке и по их количеству и площади судить об интенсивности синтеза белка. В качестве окрашивающего вещества с использованием различных методов AgЯОР учеными также были использованы 10 %-ый раствор тиосульфата натрия, 1 %-ый раствор хлорида золота.
После окрашивания серебром аргирофильные белки можно обнаружить только в ядрышке в интерфазе, при митозе в области ядрышкового организатора митотических хромосом. В ядре клеток во время интерфазы ЯОР видны в виде черных точек на желтом фоне ядер или слабоокрашенных хромосом. При этом их размер и количество отражают ядрышковую и клеточную пролиферативную активность. Для диагностики и прогноза опухолевых заболеваний используют разные параметры ЯОР, такие как количество, размер и распределение. Черные гранулы являются местом контакта серебра в клетке с соответствующими кислотными белками транскрипции и трансформации рРНК. Реакция серебрения основана на связывании нитрата серебра с негистоновыми белками хромосом (рибонуклеопротеиновые комплексы). Соответственно, интенсивность окрашивания AgЯОР-белков серебром коррелирует с транскрипционной активностью рибосомных генов.
Специфичность окраски происходит при соблюдении определенных условий (рН, температуры, времени окрашивания, концентрации серебра). Продолжительное окрашивание серебром может вызвать определенную окраску центромер хромосом и центриолей, т.к. практически все компоненты хроматина при изменении условий реакции могут быть выявлены с помощью этого метода.
Метод, основанный на связывании коллоидного серебра с негистоновыми белками (AgЯОР) является экономичным. Вследствие того, что ЯОР связано с синтезом белка, их количество увеличивается при усилении клеточного метаболизма.
Аргирофильные белки и их использование в качестве диагностики заболеваний. Аргирофильные белки играют главную роль в биогенезе рибосом, участвует в регуляции продолжительности жизни, клеточном гомеостазе, а также отвечает за целостность генома. Ядрышко более богато белками и белоксодержащими комплексами, которые являются ядерными доменами, играющими роль во многих клеточных процессах, таких как реакция на стресс или вирусные инфекции, контроль старения, секвестрация регуляторных молекул, модификация различных типов РНК и ядерный экспорт.
Аргирофильные белки, ассоциированные с ядрышковым организатором, нашли широкое применение в диагностической патологии. Надежность этого метода при оценке онкологических заболеваний заключается в подсчете ядер AgЯОР как простой и полезный способ получения данных о пролиферативном индексе как раковых, так и доброкачественных поражений. Окрашивание AgЯОР является одним из наиболее надежных методов, используемых для визуализации ядрышек в интерфазных ядрах и для определения активных хромосом, несущих ЯОР в метафазе.
Повышенная пролиферативная активность в опухолевых клетках приводит к увеличению количества ЯОР. Существует связь между уровнем окрашивания серебром и активной транскрипцией рибосомных генов. Соответственно, увеличение количества ЯОР отражает увеличение количества опухолевых клеток. Это свойство используется для определения злокачественного потенциала клеток с учетом подсчета ядрышек.
Ядрышко — это не постоянная структура, оно растворяется перед митотическим делением клетки и реорганизуется позже. Число AgЯОР прямо пропорционально скорости клеточного цикла. ЯОР являются жизненно важной частью аппарата ядрышка и нарушенная пролиферация считается ключевой характеристикой злокачественных новообразований. Поэтому, их межфазное число имеет диагностическое значение. Количество ЯОР в ядре может отражать состояние активации и степень поражения новообразований.
Связь между пролиферацией клеток, раком и ядрышковой активностью давно известна и исследования, связанные с выявлением количества ядрышковых белков, используют для прогноза различных заболеваний. Эта методика позволяет оценить потенциал распространения раковых клеток путем измерения активности ядрышек и в дальнейшем использовать это свойство для изучения роста, дифференцирования, а также других клеточных процессов, связанных с изменением функционального состояния клеток.
Увеличение количества ядрышек происходит наряду с увеличением повышенной плоидности клеток и с повышением уровня транскрипционной активности в стадии активной пролиферации клеток. Различия в размере и/или количестве ядрышек AgЯОР могут зависеть как от стадии клеточного цикла, метаболической активности клетки, так и от количества ядрышек, несущих хромосомы в определенном кариотипе. Количественный показатель пролиферативной активности клеток является наиболее объективной характеристикой клеточной популяции, используемой для ранней диагностики развития заболевания.
У человека заболевания, связанные с нарушениями функции ядрышек, делят на 2 категории: 1) рак и повышенная активность ядрышек; 2) вирусные инфекции с ядрышковыми мишенями. Также выделяют синдромы, обусловленные врожденными мутациями белков, локализованными в ядрышке (синдром Вернера, Тричера Коллинза, врожденного дискератоза).
В результате многих исследований было доказано, что большинство ЯОР антигенов, ассоциированных с клеточной пролиферацией, локализуются преимущественно в ядрышке. В то время как в активно пролиферирующих клетках ядрышки обладают более крупными размерами и размеры ядрышек коррелируют со скоростью пролиферации опухолевых клеток. Все изменения функционального состояния ядрышек в ходе клеточного цикла сопровождаются изменением количественного содержания белков. Количество ядрышек внутри клеток может варьировать, а также может изменяться их форма (овальные, круглые или нитевидные ядрышки). Доказано, что ядрышки являются предшественниками ядрышковых хромосом в интерфазе.
Е.В. Сабонеев (1989) в своих исследованиях с использованием иммуноцитогенетических методов сделал вывод о том, что интерфазные ядрышки и хромосомные ЯОР млекопитающих, окрашенные серебром, отражают транскрипционную активность генов рРНК. Также было установлено, что способность определенного сайта данной хромосомы окрашиваться серебром постоянна у данного индивидуума, в то время как существуют индивидуальные вариации в числе и распределении ЯОР и способность данной хромосомы образовывать ядрышко передается по наследству.
Многие исследователи в ходе своих экспериментов выявили, что количество РНК и белка в цитоплазме зависит от объема ядрышка и концентрации в нем РНК. Вследствие чего был сделан вывод, что клетки, синтезирующие большое количество белка, имеют большое ядрышко или много ядрышек и, соответственно, в малоактивных клетках ядрышко маленькое или достаточно трудно обнаруживаемое.
Аргирофильные белки нуклеолин и нуклеофозмин. В состав ядрышка входят несколько ферментов: РНК-полимераза-1, РНК-метилаза, топоизомераза-1; ядрышковые протеины Р80 и Р105, фосфопротеины С23 и Р100, нуклеолин и другие. У млекопитающих, как и у человека, активация клеток сопровождается увеличением содержания многих ЯОР белков. К основным аргирофильным белкам, играющим ключевую роль в синтезе рРНК относят нуклеолин (С23) и нуклеофозмин (NPM/В23). Окрашивание AgЯОР этими белками составляет 75%. Они обнаруживаются в ядрах клеток на протяжении всего жизненного цикла клетки, в то время как в S- и G-фазах отмечается увеличение их количества в 1,5-3 раза, они участвуют в регуляции функций РНК-полимеразы, транскрипции, репликации и рекомбинации ДНК, стабилизации структуры хроматина и мРНК, в регуляции митоза и апоптоза.
Научными исследованиями было доказано, что ядрышково-нуклеоплазматическая мобилизация NPM является ключевым молекулярным механизмом, определяющим его роль в клетке. Он является многофункциональным ядрышковым фосфопротеином и поддерживает структуру нуклеопротеинов, рибосомных субъединиц и ядрышек, регуляцию деления клеток и биогенеза рибосом, регулирует созревание рРНК, контролирует дупликацию центросом, участвует в реакциях при стрессах (УФ-облучение и гипоксия), стабильности генома, регуляции клеточного цикла, апоптозе, пролиферации клеток, в патологических процессах (развитие или прогрессирование рака). Многочисленные исследования связанны с важностью интерфазного количества AgЯОР в опухолевой патологии, для диагностики и прогноза различных типов рака. В то же время не описано научных доказательств использования анализа AgЯОР для критерия распознавания отличий злокачественных новообразований от доброкачественных.
Было доказано, что ядрышково-нуклеоплазматическая мобилизация NPM является ключевым молекулярным механизмом, определяющим роль NPM в клетке. Роль NPM в клетках многофакторная и наиболее значимым является общий уровень экспрессии, статус фосфорилирования и субклеточной локализации. Ядрышковый белок В23 напрямую связан с патогенезом рака. Доказательством этого является мутация гена при многих гематологических заболеваниях. Регулирование процесса нуклеоплазматической транслокации, общего уровня экспрессии и генетическое изменение NPM являются ключевыми механизмами его онкогенной активности. Нуклеофозмин/В23 локализуется в зернистой области ядрышка и связан с прерибосомными частицами, отвечающим за созревание рибосомных структур, и является мобильным ядрышковым белком, перемещающимся между ядрышками и цитоплазмой.
NPM необходим для нормальных клеточных функций и при изменении регуляция гиперэкспрессии, мутациях, транслокации, потери функции или спорадической делеции, может произойти онкогенез. Гиперэкспрессия NPM способствует росту клеток, ингибирует гибель клеток и ускоряет прогрессии цикла, способствующие вхождению в S-фазу при отсутствии p53. В тоже время этому белку отводится особая роль в подавлении опухоли.
Это свойство нуклеолина позволило отнести его к ЯОР-ассоциированным белкам. Специфическая схожесть ЯОР с серебром была доказана с помощью ультраструктурных исследований. Вследствие чего исследователи стали рассматривать этот метод в качестве диагностического критерия различных заболеваний. В ходе научных исследований было доказано, что количество AgЯОР значительно выше при злокачественных новообразованиях в сравнении с нормальными физиологическими или доброкачественными процессами, происходящими в организме. Большое по размеру ядрышко является особенностью для диагностики быстрорастущих и делящихся клеток при онкологических заболеваниях.
NPM обладает функциями подавления пролиферации и роста внутри клеток и экспрессируется как в пролиферирующих, так и в злокачественных клетках. Повышенная экспрессия нуклеофозмина идентифицирована как значимый и независимый фактор, определяемый с помощью многофакторного анализа.
Метод окрашивания AgЯОР рассматривалось многими исследователями в качестве полезного использования маркера пролиферации. Количественная оценка размера ядрышка параллельно с гистопатологической диагностикой злокачественных новообразований несколько ограничена. Метод окрашивания серебром, предложенный D. Plotton с коллегами (1986), при котором происходит окрашивание белков, ассоциированных с участками хромосом, содержащими гены рДНК (ядрышковые организаторы), позволило по-новому оценить перспективу его использования. Количество белков увеличивается за счет биогенеза рибосом и при окрашивании серебром визуализируется в виде четко очерченных черных точек, количество и площадь поверхности которых являются параметрами размера и активности ядрышек.
Многочисленные исследования, связанные с цифровой визуализацией, продемонстрировали корреляцию между повышенным содержанием AgЯОР и злокачественными образованиями. Некоторые ученые представили работы, в которых было указано на то, что количество AgЯОР коррелирует со временем удвоения клеточного цикла и при этом доля роста популяции опухолевых клеток влияет на оценку процесса. При этом другие ученые выявили корреляцию с гистологической степенью злокачественности.
Принцип, лежащий в основе метода идентификации маркера пролиферации, заключается в том, что биогенез рибосом и клеточная пролиферация тесно переплетены и для производства огромного количества необходимых белков требуется очень высокая доля метаболической активности клеток для синтеза ДНК и удвоения клеток.
D. Hernandez-Verdun (2006) в результате проведенных исследований, сделал вывод, что структура ядрышка остается практически неизменной при обычной функциональной нагрузке определенных популяций клеток. В тоже время было доказано, что в ходе клеточного цикла (дифференцирования и дедифференцирования, угнетения или активации синтеза рРНК) происходит значительная перестройка ядрышка.
В ходе работ многих ученых была выдвинута гипотеза о том, что увеличение количества ядрышек свидетельствует об амплификации рДНК, а также, что количество ядрышек может быть критерием дифференцирования клетки. Согласно литературным данным количество ядрышек в клетке может изменяться, их число зависит от генного баланса клетки. В большинстве случаев количество ядрышек в клетке меньше, чем число ЯОР. Это связано с тем, что при новообразовании ядрышки сливаются вместе (одно с другим) и тем самым можно сказать, что в образовании одного ядрышка принимают участие несколько ЯОР хромосом.
Использование ЯОР для диагностики заболеваний человека и животных.Было проведено множество исследований, направленных на выяснение взаимосвязи между белками AgЯОР и опухолями, в ходе которых было доказано, что злокачественные клетки продуцируют больше аргирофильных белков, чем незлокачественные клетки. Кроме этого, экспрессия белков при онкологических заболеваниях в тканях тесно связана с делением клеток.
Белки, ассоциированные с аргирофильной областью ядрышковых организаторов, представляют большой интерес при различных заболеваниях. Многие ученые рассматривали взаимосвязь между AgЯОР и карциномой. R. Eroz с другими исследователями (2013) выявили, что количество AgЯОР в волосяных фолликулах увеличивалось под действием гормона роста. N. Imamoglu с коллегами (2016) сообщили, что количество ядрышек значительно выше у детей с синдромом Дауна. S. Murgod с исследователями (2016) сообщили об увеличении количества ядрышек при подслизистом фиброзе полости рта и плоскоклеточном раке. А.M. Lavezzi с коллегами (2016) исследовали изменения количества AgЯОР при выявлении повреждения нейронов у новорожденных. E. Jajodia с другими исследователями (2017) изучали количество ядрышек при онкологическом поражении ротовой полости. D.S. Rao с учеными (2017) обнаружили, что количество AgЯОР значительно увеличивается при лишае и лейкоплакии. M. Gunduz и другие (2019) в своих исследованиях выявили зависимость лечения атопического дерматита от среднего числа ядер, содержащих AgЯОР, а также для подтверждения диагноза. Авторы предположили, что увеличение числа ядрышек вероятно происходит за счет увеличения клеток при воспалительном процессе, но необходимо выяснить какие патологические изменения влияют на это. Также было выяснено, что возраст при этом не имел никакого значения и не было выявлено зависимости от протекания тяжести заболевания.
Перспективы использования параметров ЯОР в ветеринарии и сельском хозяйстве заключается не только в исследовании при различных онкологических заболеваниях. Так описаны работыА.Г. Давидьян с коллегами (2017) об изучении активации и функционировании рибосомных генов в оогенезе птиц с использованием флуоресцентной иммуногистохимии (антитела против нуклеофозмина, фибрилларина, UBF1) и гибридизации нуклеиновых кислот in situ. Ими была доказана перспективность 3D-реконструкции яичника на основе серийных гистологических срезов для количественной оценки гетерогенности популяции половых клеток в яичнике неполовозрелых самок птиц. Тем самым были получены данные о функциональном статусе ЯОР в ооцитах птиц.
И.П. Бобров с другими учеными (2018) провели оценку морфофункциональной активности AgЯОР гепатоцитов крысы при холодовом стрессе. В ходе экспериментальных данных наблюдалось уменьшение морфофункциональной активности ядрышек, вследствие повреждающего действия на нуклеолярный аппарат холода.
В ходе исследований С.П. Данникова и А.Н. Квачко (2019) были проанализированы параметры AgЯОР в ядрах подоцитов почечных клубочков у нутрий в постнатальном онтогенезе с целью оценки белково-синтетической функции клеток. Было доказано, что параметры ядрышек у самцов и самок изменялись с разной периодичностью и зависели от половой принадлежности.
Е. А. Калаева и другие (2019) изучали динамику показателей белкового обмена и активности ЯОР у животных с бронхопневмонией. Ими было предложено использовать параметры активности ядрышек для подтверждения диагноза, оценки состояния организма и эффективности терапии с учетом выбора лекарственных средств, а также прогноза течения заболевания.
П.М. Кленовицкий с коллегами (2019, 2021) проводили исследования, направленные на оценку основных характеристик аргирофильных областей в интерфазных лимфоцитах коз разных генотипов и выбор основных параметров для оценки состояния ЯОР с использованием компьютерного анализа. Ученые предложили для оценки состояния ядрышкообразующей системы целесообразное использование таких критериев как число AgЯОР, средняя оптическая плотность AgЯОР, ядра и зоны свободной от AgЯОР.
Заключение
Таким образом, описанные выше данные, позволяют предполагать о перспективе применения описанных методов с использованием ЯОР для диагностики заболеваний у животных на новом уровне. Стоит также отметить, что основное свойство AgЯОР (окрашивание белков) при различных патологиях может использоваться с целью диагностики и прогноза заболеваний.
Автор: И.П. Новгородова, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории клеточной инженерии, e-mail: novg-inna2005@yandex.ru. Федеральный исследовательский центр животноводства ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста
УДК 619:616-07
https://doi.org/10.32634/0869-8155-2022-360-6-20-26
Сельское хозяйство, ветеринария, зоотехния, агрономия, агроинженерия, пищевые технологии
