Применение планирования эксперимента при разработке питательной среды в производственном цикле культивирования личинок g.mellonella l.
В современном мире большой интерес вызывает насекомое в точки зрения альтернативного источника белка в рационе человека и продуктивных животных. Новое направление в кормопроизводстве продуктивных сельскохозяйственных животных – протеин, полученный из насекомых. Для промышленного культивирования личинок необходимо отрегулировать все этапы цикла воспроизводства. С этой целью успешно выращивают в контролируемых условиях черную львинку (Hermetia illucens), мучного хрущака (Tribolium confusum) и др. Для промышленного культивирования насекомых требуется соблюдать ряд важных условий: санитарные требования, поддержание комфортных абиотических условий для жизнедеятельности и полноценное питание. Большой интерес ученые и производители уделяют большой восковой моли (Galleria mellonella L.) по причине высокого содержания мононенасыщенных жирных кислот от общей суммы жирных кислот (58%), полиненасыщенных 7%, а также 34,5% незаменимых аминокислот от общей суммы аминокислот белка, жирных кислот, витаминов.
Большая восковая моль (БВМ) (Galleria mellonella L.) – вредитель в пчеловодстве, разрушающая целостность пчелиной семьи. Цикл развития включает 4 стадии: яйцо, личинка, куколка и имаго. Основной урон пчелиным семьям причиняет личинка, которая поедает содержимое улья (мед, перга, воск, расплод), снижая продуктивность пчел.
В мировом масштабе большая восковая моль известна как универсальный модельный объект, используемый в разных направлениях исследований (токсикология, фармакология и др.). Водно-спиртовой экстракт из личинок использую в качестве профилактического и лечебного средства при лечении бронхо-легочных заболеваний, в педиатрии, в гинекологии и др. В связи с этим, что личинка благодаря своему составу имеет мультиэффект в возможном практическом применении, ее рассматривают в качестве продукта функционального питания, что дает возможность выхода ее как продукта на рынок пищевой промышленности.
На этапе культивирования насекомых в контролируемых условиях, важным этапом является подготовка питательной среды. Известно, что естественный корм (пчелиная сушь, пасечные вытопки) личинок G.mellonella не является стандартизированным по качеству и составу кормом, что ведет к нестабильным и плохо прогнозируемым производственным результатам и получению неоднородного сырья, при этом существуют трудности его хранения. Альтернативой естественному корму является искусственная питательная среда (ИПС), сбалансированная по белкам, жирам и углеводам. Исследования показывают, что в зависимости от соотношения ингредиентов ИПС меняются морфофизиологические показатели насекомых. Основным морфофизиологическим критерием для оценки эффективности корма является масса личинки. Из всего разнообразия существующих ИПС пока не разработан корм, специально предназначенный для технологического процесса культивирования личинок G.mellonella в промышленных условиях, и даже не известна степень влияния компонентов ИПС на морфофизиологические показатели личинок, на которые можно было бы ориентироваться при разработке с ИПС.
Цель исследований
Разработка математической модели основанной на экспериментальных данных необходимой в создании состава ИПС для культивирования личинок Galleria mellonella.
Методика
Для разработки методики создания математической модели необходимой для оптимизации состава корма использовались исследования морфофизиологических показателей: массы, длины, стадии развития, выживаемости личинок.
Личинки G.mellonella были взяты из маточной культуры (n=50), выращиваемые в лабораторных условиях при +300С и относительной влажности 65-70% в специально оборудованном устройстве для культивирования личинок БВМ — «Молярий». Для оценки количественных и качественных характеристик нативных личинок, отделяемых от корма, располагали в чашки Петри для дальнейшей заморозки в морозильной камере при -150С в течение не менее 3 часов. После извлечения из морозильной камеры личинки располагали на бумажный лист для визуальной оценки состояния. После оценки неподвижности и степени проморозки личинки, приступали к исследованию морфофизиологических показателей. Масса определялась взвешиванием на электронных весах (VIBRA AJ-320CE, Япония) с точностью до 0,001 г. Для измерения ширины головной капсулы личинку располагали на предметный столик бинокулярного микроскопа МБС-10. Оценка ширины головной капсулы (склеротизированая) производилась по максимально широкой точке к основанию тела путем мягкого нажатия на тело личинки, и измерения сеткой, расположенной в одном из тубусов бинокулярного микроскопа МБС-10 с калибровочным окуляром-микрометром при х40 (таблица 1).
Для повышения эффективности исследований влияния компонентов питательных сред на морфофизиологические показатели личинок G.mellonella и их привлекательность для этих личинок использовался метод математического планирования эксперимента успешно используемый и в энтомологии. Благодаря такому подходу на основании многократно меньшего количества опытов, становится возможным, получить экспериментальные зависимости целого ряда выходных параметров от входных факторов.
Для проведения эксперимента использовался план 27-4, то есть дробный факторный эксперимент, в котором производилось варьирование семи факторов – компонентов корма. За основу брали матрицу полного факторного эксперимента 23, а коэффициенты при взаимодействии трех и более факторов принимались малозначимыми и заменялись дополнительными факторами (Х5, Х6, Х7) (таблица 2).
Входные факторы варьировались на величину ±20% относительно средней точки. Средняя точка состава корма была выбрана исходя из состава Т.В. Коноваловой (2009).
После получения всех результатов измерения морфофизиологических параметров личинок производился расчет коэффициентов уравнения регрессии. Проверка коэффициентов регрессии на значимость и их отсеивание производилась по критерию Стьюдента.
где tкр – критическое табличное значение критерия Стьюдента для значения риска 0,05 и числа степеней свободы f.
Для наших условий проведения эксперимента f =16, поскольку количество опытов согласно таблице 2 было N = 8, а количество повторностей n = 3. Табличное значение критерия Стьюдента при f =16 составило 2,12.
Для определения вклада каждого исследуемого фактора на выходной параметр рассчитывается уравнение регрессии, которое выражает через величину коэффициента уравнения регрессии bi и bi.j зависимость выходного параметра от входных факторов. В общем виде уравнение регрессии имеет вид:
Поскольку данное уравнение регрессии описывает линейную модель, то оно не должно содержать квадратичных членов, то есть парные коэффициенты принимаются нулю при i=j
Коэффициенты уравнения регрессии рассчитываются по формулам
Для оценки значимости входных факторов производится сравнение коэффициентов уравнения регрессии с дисперсией коэффициентов уравнения регрессии, которая вычисляется по формуле:
где Yр – отклик, вычисляемый по уравнению регрессии; b0 – нулевой коэффициент уравнения регрессии; bi – коэффициент уравнения регрессии, отражающий вклад i-го фактора в выходной параметр; bij – коэффициент, характеризующий вклад парного взаимодействия i-го и j—го факторов. Парные коэффициенты в наших опытах не учитывались из предположения малости этого влияния и заменялись дополнительными факторами.
Поскольку все опыты производились одновременно, но в разных контейнерах, размещенных в «Молярии» случайным образом, то выделять и усреднять опыты первой, второй и третьей повторностей не имело смысла. Поэтому усреднение экспериментальных результатов производилось сразу по всем повторностям.
Результаты исследований и их обсуждение
Измерение массы личинок, их длина и ширина головной капсулы в качестве выходных параметров производилось одновременно, в результате проведенных экспериментов получились три независимых таблицы, в которых отражены значения массы, их длины и ширины головной капсулы.
Усредненные значения массы, длины и ширины головной капсулы личинок, как результат реализации матрицы планирования экспериментов Yэi1 показаны в таблице 3.
На основании экспериментальных данных для массы личинок по формуле (5) был проведен расчет коэффициентов уравнения регрессии для масс личинок. Результаты помещены в таблицу 4.
Дисперсия уравнения регрессии для массы личинок, вычисленной по формуле (6), составила 1,12*10-5, для длины личинок составила 2.08*10-5, для ширины головной капсулы личинок, составила 0,17.
Для определения значимых коэффициентов уравнения регрессии с учетом 95% уровня достоверности необходимо соблюдение условий в соответствии с формулой (2). В нашем случае этот коэффициент из таблицы Стьюдента будет равен 2,12.
Таким образом, интервал 95% достоверности определения значимости коэффициентов уравнений регрессии будет для массы личинок 0,0071, для длины личинок 0,0096, для ширины головной капсулы 0,87. С учетом вычисленных коэффициентов уравнения регрессии для масс личинок уравнение примет вид.
В уравнении регрессии для масс личинок не все коэффициенты оказались значимыми. Значимыми ингредиентами оказались пшеничная мука (X1), дрожжи (X3) и мед (X5). Все остальные ингредиенты внесли незначительный вклад в данных условиях эксперимента. При дробном факторном эксперименте происходит некоторое искажение информации, потому что хотя парные взаимодействия и могут быть малы, но они все равно вносят свой вклад в значения коэффициентов уравнения регрессии в соответствии понятием контраста дробного факторного эксперимента. Это приводит к тому, что появляется некий фон. Этот фон мы и видим на примере X2, X4. Аналогично говорить о сильном уменьшении отклика под действием факторов X4, X6, X7 не приходится. Тем не менее, полученные результаты ясно говорят, что для оптимизации состава необходимо в первую очередь увеличивать в составе корма для личинок количество пшеничной муки, дрожжей и меда. Причем самым эффективным для данного состава будет увеличение концентрации дрожжей в корме, это и понятно, потому что дрожжи будут основным источником белка в корме по составу приближенным к животному белку.
Аналогично можно провести анализ для уравнения регрессии для длины личинок. Как и в случае с массой личинок не все коэффициенты уравнения регрессии для длины личинок оказались значимыми. Уравнение регрессии для длины личинок примет вид
В уравнении регрессии (8) для длин личинок, хотя все члены уравнения и являются значимыми ингредиентами (bi≥0,0096), но наиболее значимыми ингредиентами, которые вносят максимальный вклад, опять являются дрожжи (X3) и мед (X5) и мука (X1). Все остальные ингредиенты вносят значительно меньший вклад. Самым сильно влияющим фактором в уравнении регрессии (8), как и в уравнении (7), который больше суммы всех других положительных коэффициентов уравнения регрессии, являются дрожжи. Это и понятно, потому что как и для массы личинок дрожжи являются основным поставщиков белковой компоненты.
Уравнения регрессии для ширины головной капсулы личинок строится аналогично двум предыдущим уравнениям. В отличие от двух предыдущих уравнений регрессии (7) и (8) в уравнении регрессии (9) появились незначимые члены, которые меньше величины 0,87, определенной ранее, как дисперсия коэффициентов уравнения регрессии умноженной на табличное значение критерия Стьюдента для 95% уровня достоверности. Уравнение регрессии для ширины головной капсулы личинок примет вид.
Ширина головной капсулы определяет возраст личинок восковой моли. В таком случае увеличение положительных значений коэффициентов в уравнении регрессии (9) соответствует ускорению созревания личинок, то есть ускорению жизненного цикла большой восковой моли. Полученные уравнения регрессии дают возможность математического моделирования в рамках линейной модели представленной уравнениями регрессии в исследованном диапазоне морфологических показателей личинок в зависимости от состава корма.
Выводы
- Для всех трех уравнений регрессии наибольшее влияние оказывает увеличение в составе корма пшеничной муки, кормовых дрожжей и меда.
- На основе полученных выше результатов была разработана искусственная питательная среда с увеличением ключевых ингредиентов на 20%.
Авторы:
А.С. Осокина, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, Удмуртский Федеральный Исследовательский Центр УрО;
А.В. Гущин, директор ООО «М-Технологии»;
Э.А. Аникина, студент, Удмуртский государственный университет.
УДК 634.723.1.631.527 https://doi.org/10.32634/0869-8155-2022-358-4-104-108
Сельское хозяйство, ветеринария, зоотехния, агрономия, агроинженерия, пищевые технологии
